高效陰離子交換色譜法同時(shí)測定菊粉酶解產(chǎn)物中的單糖、雙糖和低聚果糖

徐艷冰，鄭兆娟，徐 穎，孫秀程，許茜茜，歐陽嘉,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

高效陰離子交換色譜法同時(shí)測定菊粉酶解產(chǎn)物中的單糖、雙糖和低聚果糖

徐艷冰1，鄭兆娟2,3，徐 穎1，孫秀程1，許茜茜2，歐陽嘉2,3,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

建立了低聚果糖樣品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的高效陰離子交換色譜-脈沖安培法的定量分析方法。采用陰離子交換柱CarboaPacTMPA10（250 mm×2 mm）脈沖安培法進(jìn)行檢測，以氫氧化鈉和醋酸鈉為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min。結(jié)果表明，葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖在質(zhì)量濃度0.1～10 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2大于0.996 1，各組分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2.69%～7.21%之間。將此方法應(yīng)用于菊粉酶解后反應(yīng)產(chǎn)物的檢測，結(jié)果表明該方法快速簡便且靈敏度高，能滿足反應(yīng)樣品中低聚果糖的檢測要求。

高效陰離子交換色譜；菊粉；低聚果糖

低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS），是由2～10 個(gè)單糖通過β-2,1-糖苷鍵連接形成的直鏈低度聚合糖[1]，也是一種純天然、高效能、無公害的綠色食品和飼料添加劑，還是雙歧桿菌的增殖因子，有多種生理功能[2-3]。菊粉是由β-呋喃果糖以β-2,1-糖苷鍵相連，并在其還原端接一個(gè)α-吡喃葡萄糖基的果聚糖，呈直鏈結(jié)構(gòu)[4-5]。菊粉主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鮮薊等植物體的根部或莖部，是一種來源豐富的可再生資源。菊粉酶按其作用于糖苷鍵的方式不同分為內(nèi)切型和外切型兩類[6]。外切菊粉酶作用于菊粉鏈果糖末端的糖苷鍵，逐一水解釋放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要產(chǎn)物為果糖；內(nèi)切菊粉酶作用于菊粉內(nèi)部，隨機(jī)從菊粉鏈內(nèi)部切斷糖苷鍵，降解產(chǎn)物主要為低聚果糖[7]。

目前糖類的分析和檢測主要采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-12]。由于低聚果糖樣品是由不同聚合度的低聚糖組成的混合物，采用普通的HPLC法不能有效分離分析這些組分[13-15]，從而使得低聚果糖難以進(jìn)行定量分析，限制了產(chǎn)品質(zhì)量的鑒定[16]。新型的有機(jī)高聚物陰離子交換固定相在pH 0～14范圍內(nèi)穩(wěn)定；糖類化合物具有弱酸性及親水性，在比較強(qiáng)的堿性溶液中以陰離子形態(tài)存在；因此可用強(qiáng)堿性溶液做流動(dòng)相進(jìn)行陰離子交換分離。與HPLC法相比[17-19]，高效陰離子交換色譜（high performance anion exchange chromat ography，HPAEC）可利用不同相對分子質(zhì)量的低聚糖之間羥基解離度的細(xì)微差異實(shí)現(xiàn)它們的精確分離，具有操作方便、針對性強(qiáng)、靈敏高和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[20-21]，適用于低聚糖的定性分析和定量檢測。本實(shí)驗(yàn)采用CarboaPacTMPA10陰離子交換柱，利用HPAEC-脈沖安培檢測（pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）建立了低聚果糖樣品的定量分析方法，從而達(dá)到高效、快速分離葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖（1-kestose，GF2）、蔗果四糖（nystose，GF3）和蔗果五糖（fructofuranosyl nystose，GF4）的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊粉 青海威德生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、蔗糖、GF2、GF3、無水醋酸鈉 美國Sigma公司；果糖上海國藥集團(tuán)；GF4 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；500 g/L氫氧化鈉溶液 美國Fluka公司。實(shí)驗(yàn)用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ?cm的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000離子交換色譜系統(tǒng)、CarboaPacTMPA10分析柱（250 mm×2 mm）、CarboaPacTMPA10保護(hù)柱（50 mm×2 mm） 美國Dionex公司；AS40自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PAD（Au工作電極，pH-Ag/AgCl復(fù)合參比電極）、色譜工作站 美國Chromeleon公司；超純水設(shè)備 法國ELGA LabWater公司；離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用超純水將葡萄糖、果糖、蔗糖、GF2、GF3和GF4分別配成一定質(zhì)量濃度的母液，取適量母液配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后標(biāo)注配制時(shí)間并于-20 ℃條件下冷凍保存。使用前取出解凍至室溫，取等量同濃度級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后作為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 淋洗液的配制

200 mmol/L NaOH溶液：取500 g/L NaOH溶液10.5 mL，用超純水稀釋至1 L并定容，混勻后立即通氮?dú)猓?1.3～55.1 kPa（6～8 psi））保護(hù)。500 mmol/L NaAc溶液：稱取20.5 g無水NaAc固體，用超純水溶解后轉(zhuǎn)至500 mL容量瓶中，加入500 g/L NaOH溶液2.6 mL后定容，混勻后經(jīng)0.22 μm醋酸纖維膜過濾，立即通氮?dú)猓?1.3～55.1 kPa（6～8 psi））保護(hù)。

1.3.3 樣品的制備

在200 g/L菊粉中加入60 U/g菊粉酶（由本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，來自于Aspergillus niger DSM 2466），在60 ℃、pH 4.6條件下反應(yīng)8 h，反應(yīng)結(jié)束后，取酶解產(chǎn)物于100 ℃滅活5 min，10 000 r/min條件下離心5 min。離心后取上清液，用超純水稀釋至檢測濃度范圍后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)行檢測和分析。

1.3.4 色譜條件

以200 mmol/L NaOH、500 mmol/L NaAc為淋洗液進(jìn)行二元梯度洗脫；淋洗程序：0～10 min，NaOH溶液濃度為40 mmol/L；10～25 min，NaOH溶液濃度從180 mmol/L線性升至200 mmol/L，同時(shí)NaAc溶液濃度從50 mmol/L降至0 mmol/L；25～55 min，以40 mmol/L NaOH溶液沖洗系統(tǒng)；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測器：四電位PAD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

鑒于糖類化合物分子具有電化學(xué)活潑性及在強(qiáng)堿溶液中呈離子化狀態(tài)，Rocklin等[22]于1983年首先報(bào)道了用陰離子交換色譜柱分離，PAD測定糖的方法。大多糖類化合物呈弱酸性，在強(qiáng)堿溶液中會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，因此可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離。表1列出了常用的分離糖的陰離子交換分離柱和主要應(yīng)用。

表1 分析糖的色譜柱及其應(yīng)用Table 1 Chromatographic columns for analysis of carbohydrates

由表1可知，CarboPac MA1能很好地分離 糖醇化合物[23]，但是葡萄糖的保留時(shí)間長達(dá)24 min，其他糖的保留時(shí)間也長到不可接受的程度。CarboPac PA100和PA200主要用于分離低聚糖，而CarboPac PA1、PA10和PA20則是用于分離單糖和小分子低聚糖的陰離子交換柱。已有文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道，CarboPac PA1存在明顯的溶解氧負(fù)峰，會(huì)干擾待測糖類的分離效果，而溶解氧在CarboPac PA10色譜柱的固定相上的保留較強(qiáng)，從而避免了其對單糖的干擾，并且低聚糖在CarboPac PA10色譜柱上也可以得到較好的分離。CarboPac PA20柱容量較小，常用于快速分離單糖或雙糖，但單糖與雙糖的分離度較差，低聚糖的分離效果也略差于CarboPac PA10柱?？紤]到本實(shí)驗(yàn)需要分析的6 種糖的分析效果，選擇CarboPac PA10色譜柱進(jìn)行相關(guān)測定。

2.1.1 流速的選擇

淋洗液的流速對色譜的分離有影響，在一定條件下增加流速會(huì)使分離度減小、峰面積減小、峰寬變窄。通過不同流速條件下對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離效果來判斷流速對分離效果的影響?？疾炝肆魉僭?.2～0.4 mL/min范圍內(nèi)的影響，其他條件同1.3.4節(jié)。從圖1可以看出，隨著流速的降低各組分的保留時(shí)間都有所延長，且分離度也增加，但分離效果不明顯。綜合考慮分離度和分離時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)最終選擇的流速為0.3 mL/min。

圖1 流動(dòng)相流速對分離效果的影響Fig.1 Effects of mobile pha se flow rate on the separation

2.1.2 醋酸鈉添加時(shí)間

為提高洗脫效果，用水、氫氧化鈉和醋酸鈉進(jìn)行三元梯度洗脫。當(dāng)被洗脫成分與固定相親和力強(qiáng)（如寡糖、多糖等）時(shí)，需要在淋洗液中加入比較強(qiáng)的淋洗離子，無電化學(xué)活性的Ac-常被加入。由于低聚果糖成分復(fù)雜，分離時(shí)常采用梯度淋洗的方式。本實(shí)驗(yàn)探究了5～15 min范圍內(nèi)添加醋酸鈉梯度淋洗對洗脫效果的影響。如圖2所示，可以看出在5 min時(shí)添加醋酸鈉，各組分分離效果不佳，不利于定量分析。而在15 min時(shí)添加醋酸鈉，會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間過長。因此選擇在10 min時(shí)添加醋酸鈉流動(dòng)相。

圖2 醋酸鈉添加時(shí)間對分離效果的影響Fig.2 Effects of addition time of sodium acetate on the separation

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物的確定

在1.3.4節(jié)的色譜條件下測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各組分的保留時(shí)間；再測定混合標(biāo)準(zhǔn)液，得到混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖（圖3）。由圖3可以看出，各物質(zhì)的出峰順序及時(shí)間為葡萄糖（8.817 min）、果糖（10.400 min）、蔗糖（13.017 min）、GF2（16.900 min）、GF3（20.450 min）、GF4（23.017 min）。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性關(guān)系、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率

表2 6種標(biāo)準(zhǔn)糖的線性方程、線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations with linear ranges and correlationcoefficients (r2) for six sugars

表3 樣品中葡萄糖、果糖、蔗糖、GF2、GF3和GFF44的加標(biāo)回收率（n＝33）Table 3 Recoveries of glucose, fructose, sucrose, 1-kestose, nystose,and fructofuranosyl nystose spiked into real sample (ｎ= 3)

將10 g/L 6 種糖標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 mg/L和10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜條件下檢測，根據(jù)各峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得到6 種標(biāo)準(zhǔn)糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。向標(biāo)準(zhǔn)樣品中添加低、中、高3 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液，每個(gè)水平重復(fù)測定3 次，計(jì)算方法的回收率。從表3可以看出，回收率在89.06%～108.25%之間。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3節(jié)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測得各組分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2.69%～7.21%之間。

2.3 實(shí)際樣品分析

將菊粉酶酶解菊粉的產(chǎn)物10 000 r/min離心后，取上清液，稀釋2 000 倍，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，在1.3.4節(jié)中色譜條件下進(jìn)行分析，測得各組分的質(zhì)量濃度，見表4，其中GF2、GF3和GF4的總得率達(dá)到了49.07%。

表4 樣品中低聚果糖的檢測結(jié)果（n=3）Table 4 Determination of FOS in samples (n=3))

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單快速地分析菊粉經(jīng)內(nèi)切菊粉酶酶解后所得產(chǎn)物的方法，由HPAEC柱分離后通過PAD進(jìn)行檢測，得到樣品中葡萄糖、果糖、蔗糖、GF2、GF3和GF4的含量。本方法相對于其他的常規(guī)方法，靈敏度高、處理步驟簡單、無需衍生，稀釋后可直接進(jìn)行檢測，是一種測定菊粉酶解樣品中單糖、雙糖和低聚果糖的有效方法。

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Simultaneous Determination of Monosaccharides, Disaccharides, and Fructooligosaccharides in Inulin Hydrolysates by High Performance Anion Exchange Chromatography

XU Yanbing1, ZHENG Zhaojuan2,3, XU Ying1, SUN Xiucheng1, XU Qianqian2, OUYANG Jia2,3,*
(1. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing 210037, China)

An analytical method for the simultaneous determination of glucose, fructose, sucrose, kestose, nystose, and fructofuranosylnystose in fructooligosaccharide products was developed by using high performance anion exchange chromatography coupled with pulsed ampere detection (HPAEC-PAD). The analysis was performed on a CarboPacTMPA10 column（250 mm × 2 mm）by gradient elution using NaOH-NaAc as the mobile phase. The column temperature was set at 30 ℃, and the fl ow rate was 0.3 mL/min. The results showed that the calibration curves developed for glucose, fructose, sucrose, kestose, nystose and fructofuranosylnystose had a good linear relationship within the concentration range of 0.1–10 mg/L (r2＞ 0.996 1). The relative standard deviation for six repetitive determinations of each sugar was between 2.69% and 7.21%. Thi s method is convenient, simple, and sensitive for the detection of fructooligosaccharide products from the enzymatic hydrolysis of inulin.

high performance anion exchange chromatography; inulin; fructooligosaccharides

10.7506/spkx1002-6630-201602013

TS245.9

A

1002-6630（2016）02-0077-05

徐艷冰, 鄭兆娟, 徐穎, 等. 高效陰離子交換色譜法同時(shí)測定菊粉酶解產(chǎn)物中的單糖、雙糖和低聚果糖[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 77-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602013. http://www.spkx.net.cn

XU Yanbing, ZHEN Zhaojuan, XU Ying, et al. Simultaneous determination of monosaccharides, disaccharides, and fructooligosaccharides in inulin hydrolysates by high performance anion exchange chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(2): 77-81. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602013. http://www.spkx.net.cn

2015-05-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200443；31300487）；江蘇省杰出青年基金項(xiàng)目（BK2012038）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA022301）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130970）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（BF2015007）

徐艷冰（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物。E-mail：xuyanbing90@126.com

*通信作者：歐陽嘉（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锢w維資源利用、基因工程和酶工程。E-mail：hgouyj@njfu.edu.cn