程序性細(xì)胞死亡因子4與氨基末端腦利鈉肽前體在冠心病猝死者體內(nèi)的表達(dá)及意義

劉篤秋 陳剛 吳旭庭 王鎮(zhèn)波 庾宇軍

[摘要]目的 研究冠心病猝死患者心肌組織中程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）的表達(dá)量與心血中氨基末端腦利鈉肽前體（NTproBNP）的表達(dá)變化，探討其在冠心病猝死者體內(nèi)的表達(dá)及意義。方法 選取2015年7月～2018年6月于南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院死亡并接受尸檢的死亡病例60例，根據(jù)尸檢結(jié)果分為冠心病猝死組（20例）、冠脈狹窄組（20例）以及冠脈正常組（20例），每個(gè)病例均收集心肌組織一塊用于測(cè)定PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量，并抽取右心血樣本采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血漿NTproBNP的水平。結(jié)果 冠心病猝死組心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量、蛋白表達(dá)量均高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；冠心病猝死組、冠脈狹窄組的血漿 NTproBNP含量均高于冠脈正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；冠心病猝死組的血漿NTproBNP含量高于冠脈狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 PDCD4、NTproBNP的高表達(dá)與冠心病猝死的發(fā)生有關(guān)，能輔助判定冠心病的嚴(yán)重程度以及協(xié)助鑒定冠心病猝死。

[關(guān)鍵詞]冠心??；心源性猝死；程序性細(xì)胞死亡因子 4；氨基末端腦利鈉肽前體

[中圖分類號(hào)] R541.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）12（c）-0004-05

[Abstract] Objective To analyse the expression of programmed cell death 4 （PDCD4） in myocardial tissues and Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide （NTproBNP） in plasma of sudden death patients with coronary heart disease and to discuss its significance. Methods Totally 60 sudden death cases that underwent autopsy in the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University from July 2015 to June 2018 were collected， and divided into sudden cardiac death with coronary heart disease group （20 cases）， single coronary stenosis group （20 cases） and normal control group （20 cases） according to the autopsy results. The myocardial tissue was collected to determine the mRNA expression of PDCD4 as well as the protein expression of PDCD4. NTproBNP in plasma were detected by ELISA. Results The mRNA expression and protein expression of PDCD4 in myocardial tissue of cardiac sudden death with coronary heart disease group were significantly higher than those in the other two groups， the differences were statistically significant （P<0.05）. NTproBNP in the sudden cardiac death with coronary heart disease group and single coronary stenosis group was higher than that normal control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. NTproBNP in the sudden cardiac death with coronary heart disease group was higher than that in the single coronary stenosis group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion These indicate that PDCD4 and NTproBNP have a certain guiding role in sudden cardiac death with coronary heart disease. PDCD4 and NTproBNP can help to identify the severity of coronary heart disease and whether it is sudden death due to coronary heart disease.

[Key words] Coronary heart disease； Sudden cardiac death； Programmed cell death 4； Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈發(fā)生了動(dòng)脈粥樣硬化病變，繼而引起冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞性改變，造成心肌缺血、缺氧，甚至壞死而導(dǎo)致的心臟疾病，簡(jiǎn)稱冠心病。嚴(yán)重的冠心病能導(dǎo)致患者出現(xiàn)心肌梗死、惡性心律失常以及心力衰竭等，甚至?xí)＜盎颊呱９谛牟》譃槲宕箢愋?，冠心病猝死是其中的一種分型，由于冠心病猝死的突然性以及不可預(yù)測(cè)性，給臨床診療工作中產(chǎn)生極大困擾。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一種腫瘤抑制因子，而近年來(lái)有研究顯示其不僅對(duì)細(xì)胞的程序性死亡起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且與心血管細(xì)胞生物學(xué)也存在著非常密切的關(guān)系，并在動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展的過(guò)程中也起著重要的作用[1]。氨基末端腦利鈉肽前體（Amimo-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide，NTproBNP）作為腦利鈉肽前體的裂解產(chǎn)物之一，其血漿分布量與心功能不全、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變等多種心臟疾病有關(guān)，對(duì)心肌缺血、缺氧以及心臟缺血再灌注等病理生理改變極為敏感，與冠脈狹窄、心肌梗死的程度呈正相關(guān)[2]，可用于臨床上判斷冠心病患者的預(yù)后以及預(yù)計(jì)相關(guān)死亡率[3]。本研究通過(guò)分析冠心病猝死患者心肌組織中PDCD4的表達(dá)量以及心血中NTproBNP的表達(dá)變化，探討其對(duì)冠心病心肌損傷的臨床診療意義，旨在為冠心病猝死的診斷和鑒定提供依據(jù)，對(duì)預(yù)防冠心病猝死尋找相應(yīng)輔助預(yù)測(cè)檢驗(yàn)指標(biāo)提供新的思路及方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年7月～2018年6月于南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院死亡并接受尸檢的病例資料60例，根據(jù)尸檢結(jié)果及法醫(yī)鑒定分為冠心病猝死組（20例，年齡28～72歲）、冠脈狹窄組（20例，年齡27～76歲）以及冠脈正常組（20例，年齡26～78歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①冠心病猝死組均為冠狀動(dòng)脈或其分支狹窄程度≥Ⅲ級(jí)，因冠心病急性發(fā)作1 d內(nèi)死亡；②冠脈狹窄組選取冠狀動(dòng)脈或其分支狹窄程度≥Ⅲ級(jí)，死亡原因?yàn)榉枪谛牟?dǎo)致的案例；③正常冠脈組選取冠脈無(wú)明顯狹窄病變的死亡病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①冠脈正常組冠心病、心力功能不全等心源性疾病；②過(guò)敏性疾??；③治療嗎啡過(guò)量以及毒品中毒等藥物干擾因素。三組的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表 1），具有可比性。本研究已通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，均已征得研究對(duì)象家屬的書(shū)面同意。

1.2標(biāo)本收集

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本包括尸檢所提取的心肌組織與右心血。所有的入選案例均需在患者死后6 h內(nèi)將尸體冷凍保存，并且在3 d內(nèi)進(jìn)行尸檢。冠心病猝死組患者行尸檢時(shí)提取200 mg缺血損傷部位的心肌組織，同時(shí)取右心血10 ml；冠脈狹窄組患者行尸檢時(shí)提取200 mg狹窄冠脈支配血流范圍內(nèi)心肌組織，同時(shí)取右心血10 ml；冠脈正常組患者尸檢時(shí)提取200 mg與冠心病猝死組患者提取標(biāo)本相對(duì)應(yīng)部位的心肌組織，同時(shí)取右心血10 ml。所有采集的心肌組織標(biāo)本在液氮中快速冷凍后取出，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。所有采集的右心血標(biāo)本均經(jīng)離心機(jī)分離，取血漿分裝入EP管并放置于-80℃冰箱保存待檢。在凍存前需要確保所有收集的血漿未發(fā)生明顯溶血。

1.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

觀察指標(biāo)：①心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量；②血漿中NTpro BNP的含量。

從每個(gè)病例所采集的心肌組織標(biāo)本中精確分離50 mg，并使用TRIzon法提取這50 mg心肌組織中的總RNA。進(jìn)一步使用相應(yīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行核糖核酸（RNA）反轉(zhuǎn)錄，獲取互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）模板。使用PDCD4的特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，根據(jù)相應(yīng)基因的PCR曲線，由軟件自動(dòng)計(jì)算出信息核糖核酸（mRNA）相對(duì)表達(dá)量。

同樣提取心肌組織標(biāo)本100 mg，以預(yù)冷生理鹽水充分洗滌，液氮充分預(yù)冷后研磨成粉。采用RIPA裂解液分離組織內(nèi)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步孵育、離心，取上清液，得到心肌總蛋白。采用試劑盒對(duì)蛋白裂解液內(nèi)PDCD4的蛋白表達(dá)量進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定。

提取右心血分離的血漿標(biāo)本，加入抗體工作液后置于恒溫振蕩器上孵育。洗滌液充分洗滌后加入酶標(biāo)抗體工作液，進(jìn)一步孵育后加入底物工作液。繼續(xù)避光孵育15 min，加入終止液。最后置于酶標(biāo)儀測(cè)量，并由軟件自動(dòng)換算輸出血漿NTpro BNP濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

冠心病猝死組心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量均高于冠脈狹窄組和冠脈正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；冠脈狹窄組心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量與冠脈正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；冠心病猝死組、冠脈狹窄組的血漿NTproBNP含量均高于冠脈正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；冠心病猝死組的血漿NTproBNP含量高于冠脈狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變，進(jìn)而出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞性改變，造成心肌不同程度的缺血、缺氧，甚至壞死而導(dǎo)致的心臟疾病，簡(jiǎn)稱冠心病[4-5]。嚴(yán)重的冠心病能導(dǎo)致患者出現(xiàn)心肌梗死、惡性心律失常以及心力衰竭等，甚至?xí)＜盎颊呱！?013 中國(guó)心血管病報(bào)告》[6]中統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，心血管疾病從1990年起，就一直是我國(guó)居民的主要死亡原因。直至2012年，在我國(guó)的城市地區(qū)以及農(nóng)村地區(qū)，心血管病都已成為當(dāng)?shù)鼐用竦氖滓劳鲈?，在全部死亡原因中的占比達(dá)到了40%。該報(bào)告預(yù)計(jì)到2020年，我國(guó)居民因心血管疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)將至少增加50%。因動(dòng)脈粥樣硬化性疾病死亡的人數(shù)在心血管病致死總數(shù)中占據(jù)相當(dāng)大的一部分，其中冠心病及其相關(guān)的并發(fā)癥，在全世界致死率的主要發(fā)生因素中也占據(jù)著極大比重[7]。

冠心病猝死是冠心病的五大類型之一，是指冠狀動(dòng)脈因狹窄或者痙攣病變導(dǎo)致的心肌供血不足、心肌功能障礙，甚至心臟器質(zhì)性病變而引起的猝死[8-9]。由于冠心病猝死的突然性以及不可預(yù)測(cè)性[7]，給臨床診療工作中產(chǎn)生極大困擾。一些特異性蛋白標(biāo)志物雖然已在臨床上用于輔助診斷急性冠脈綜合征，包括肌紅蛋白、肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶等[10-13]。但由于這類標(biāo)志物在血液中產(chǎn)生和到達(dá)峰值的時(shí)間不同，同時(shí)半衰期的長(zhǎng)短存在差別，故在冠心病猝死的診斷中受到極大限制[14]。

如今在我國(guó)各級(jí)醫(yī)療單位的醫(yī)療條件不斷改善、醫(yī)療水平均持續(xù)上升的大背景下。冠心病的死亡率，包括其中的急性心肌梗死的死亡率，以及冠心病猝死的發(fā)生率仍未明顯下降，即使國(guó)內(nèi)現(xiàn)廣泛開(kāi)展成立針對(duì)急性冠脈綜合征等高危胸痛疾病的胸痛中心[15]，而其死亡率依舊在繼續(xù)上升。所以冠心病猝死相關(guān)的機(jī)制研究也一直是心血管領(lǐng)域研究的熱門(mén)。

PDCD4是近年新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子，但與心血管細(xì)胞生物學(xué)也存在著非常密切的關(guān)系。PDCD4基因的表達(dá)受到多種不同因素的調(diào)節(jié)[16]，包括TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)。無(wú)論血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞在抑制增殖抑或促進(jìn)程序性死亡的過(guò)程中，PDCD4均起著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。已有研究結(jié)果顯示，PDCD4基因的低表達(dá)與維持內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)內(nèi)皮功能的穩(wěn)定存在著極為密切的聯(lián)系，同時(shí)，血管內(nèi)皮功能的正常與否和動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生也密切相關(guān)[18]。提示PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展的過(guò)程中也起著重要的作用[19]。由于近年來(lái)對(duì)冠心病發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)注，PDCD4也逐漸成為動(dòng)脈粥樣硬化方面研究的熱點(diǎn)。

腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）主要由心室肌細(xì)胞分泌，其主要作用如下。①舒張全身小血管的平滑?。虎谝种平桓猩窠?jīng)系統(tǒng)的興奮性；③降低心臟的后負(fù)荷。對(duì)于冠脈疾病來(lái)說(shuō)，BNP具有極好的預(yù)測(cè)及評(píng)估能力，故已被推薦應(yīng)用于急性冠脈綜合征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[20]。NTproBNP作為腦利鈉肽前體的裂解產(chǎn)物之一，其血漿分布量與心功能不全、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變等多種心臟疾病有關(guān)，對(duì)心肌缺血、缺氧以及心臟缺血再灌注等病理生理改變極為敏感。相關(guān)研究顯示在冠心病猝死患者心肌組織中BNP表達(dá)量較過(guò)敏性猝死患者和顱腦損傷死亡患者心肌組織中BNP表達(dá)量顯著升高[21]，提示BNP可以輔助診斷冠心病猝死。

NTpro BNP是與BNP同時(shí)生成的一種無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，兩者密切相關(guān)[22]，也應(yīng)具有診斷冠心病猝死的可能性。且因BNP容易降解，在體外試管中較難保存[23]。于法醫(yī)學(xué)鑒定過(guò)程中，尸體往往會(huì)受到死亡時(shí)間、死亡現(xiàn)場(chǎng)以及保存條件等大量不確定性因素的影響，心肌組織會(huì)發(fā)生不同程度的腐敗，其中的BNP也會(huì)有著不同程度的降解。所以BNP的精確度常因干擾因素影響出現(xiàn)偏差，這樣會(huì)影響數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，故而限制了BNP的使用范圍。而NTproBNP比BNP的半衰期更長(zhǎng)，且更加穩(wěn)定，不易受保存條件影響，在冠心病猝死的鑒定工作前景更佳。

本研究通過(guò)檢測(cè)冠心病猝死組患者心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示其顯著高于冠脈狹窄組和冠脈正常組，而冠脈狹窄組心肌組織中PDCD4的mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量與冠脈正常組相比無(wú)顯著性差異。進(jìn)一步提示PDCD4的高表達(dá)與冠心病心源性猝死存在相關(guān)性，可為冠心病猝死的診斷和鑒定提供依據(jù)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)冠心病猝死患者右心血分離血漿中NTproBNP含量的檢測(cè)，結(jié)果顯示其較冠脈狹窄組和冠脈正常組均顯著增高，并且冠心病猝死組較冠脈狹窄組血漿NTproBNP仍顯著升高，提示了NTpro BNP可能反映心肌缺血嚴(yán)重程度，并可作為輔助診斷冠心病猝死的參考指標(biāo)，提示對(duì)PDCD4以及NTpro BNP的進(jìn)一步研究，于冠心病猝死的診斷及鑒別鑒別有著極重要的意義。因此PDCD4、NTpro BNP有望應(yīng)用于實(shí)際臨床及法醫(yī)工作中，能夠根據(jù)其表達(dá)量的差異來(lái)輔助診斷冠心病猝死，同時(shí)應(yīng)用于區(qū)分冠心病猝死者、伴有冠脈狹窄而非心源性因素致死者。但其中具體機(jī)制仍有待深入研究。

綜上所述，PDCD4與NTproBNP可能是冠心病心肌損傷中的關(guān)鍵標(biāo)志物，對(duì)冠心病心肌損傷的臨床診療以及冠心病猝死的法醫(yī)鑒定上具有一定的指導(dǎo)作用。但本次研究仍然具有一定局限性：關(guān)于不同心血管病和心源性猝死相應(yīng)NTproBNP表達(dá)的具體差異，仍需要進(jìn)一步的研究；研究樣本量相對(duì)較少，尚需更大量的樣本量使研究結(jié)果更確切。上述問(wèn)題有待在以后的研究中繼續(xù)完善和進(jìn)一步探討。

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