莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠海馬細胞周期蛋白表達的影響*

劉婷婷 許棟明 孫芳玲 鄭文榮 祝自新 田 欣 郭德玉 王 文

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053) (2. 科技部火炬高技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)中心，北京 100038)

缺血性腦卒中是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因之一[1]。很多信號通路參與調(diào)節(jié)缺血性腦卒中的病理生理過程，細胞周期相關(guān)蛋白的異常激活是缺血性腦損傷后的重要調(diào)控機制，其與神經(jīng)細胞的凋亡密切相關(guān)，是調(diào)控缺血后神經(jīng)細胞死亡的一個重要因素[2]。在細胞正常分裂時，細胞周期相關(guān)蛋白的激活可以促進細胞分裂增殖，但許多疾病中，病理刺激導(dǎo)致細胞周期調(diào)控機制紊亂，細胞周期相關(guān)蛋白異常激活，使處于分化末期的部分神經(jīng)細胞再次進入細胞周期，最終導(dǎo)致細胞死亡。很多蛋白參與調(diào)控細胞周期的過程，其中包括cyclins、cyclin激活酶(cyclin-activated kinases, CDKs)、cyclin激酶抑制劑CDKIs(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKIs)等。細胞周期激活以后D型cyclins合成，其與CDK6結(jié)合后促進細胞從G0進入G1期，該過程為進入細胞周期的起始，也是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵。有研究表明，通過降低D型cyclins及其激酶，抑制細胞由G0進入G1期，可以減少大腦缺血性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡[3]。通過抑制缺血性腦損傷后細胞周期相關(guān)蛋白的異常激活，可以起到神經(jīng)保護的作用。

莫諾苷是從中藥山茱萸中提取的一種單體化合物，我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其對缺血性腦卒中損傷大鼠有抗炎、抗凋亡、改善大鼠神經(jīng)功能的作用[4-5]。在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗用蛋白免疫印跡的方法進一步研究莫諾苷是否可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中大鼠患側(cè)海馬CyclinD1、CDK6的蛋白表達情況，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：成年雄性 Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量260～280 g，SPF級，合格證編號：SYXK(京)2017-0033， 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2實驗試劑及藥品：CyclinD1小鼠單克隆一抗(WH0001019M3)，CDK6小鼠單克隆一抗(WH000102M1)購自美國Sigma公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)購自北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RIPA 裂解液(P0013B)購自碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)購自美國 THERMO-PIERCE公司。莫諾苷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物室從中藥山茱萸中提取，HPLC分析純度大于98.5%。

1.2 方法

1.2.1大鼠MCAO模型制作及分組：大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用改良Zea Longa線栓法[6-7]制備局灶性腦缺血再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛 3.5 mL/kg進行麻醉，將直徑為0.26 mm的尼龍線從右頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，至距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處約 1.8 cm時，會有阻擋感，說明栓線已越過大腦中動脈，到達大腦前動脈的起始部。栓塞30 min后，拔出尼龍線。假手術(shù)組除不插入尼龍線外其他操作與手術(shù)組相同。根據(jù)5分制評分方法，剔除模型不成功的大鼠后，隨機分為5組：假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、 大(270 mg/kg)劑 量 組。術(shù)后連續(xù)灌胃給藥 7 d，每天給藥 1 次，其中假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.2.2Western blot分析：術(shù)后 7 d，大鼠 10%水合氯醛 3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉。迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)?，取出患?cè)海馬包入錫箔紙中，放入液氮中凍存片刻，-80 ℃保存。取患側(cè)海馬于 5 mL EP 管中稱重，加入預(yù)冷的裂解液 7 μL/mg組織、PMSF 1 μL/100 μL RIPA，冰上充分超聲粉碎。4 ℃靜止 30 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min。取上清測定蛋白濃度，總蛋白與 5×上樣緩沖液 1∶4稀釋，95 ℃變性10 min。

采用 10% SDS-PAGE 分離膠，濃縮膠用 5% SDS-PAGE。電泳：濃縮膠電壓60 V，40 min，分離膠電壓90 V，90 min，分離蛋白。電泳后用 0.45 μm NC 膜進行轉(zhuǎn)膜；條帶在 5%脫脂奶粉中封閉 2 h；分別用小鼠單克隆CyclinD1 抗體(1∶1000)、小鼠單克隆CDK6抗體(1∶1000)和小鼠單克隆β-actin 抗體(1∶1000)，4 ℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加相應(yīng)辣根過氧化物酶結(jié)合二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌 3次，每次 10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。用Quanity One軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對患側(cè)海馬CyclinD1蛋白表達的影響

用Western blot 的方法檢測局灶性腦缺血大鼠患側(cè)海馬CyclinD1蛋白表達的情況。如圖1所示，與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，莫諾苷中劑量組與大劑量組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達顯著降低(P<0.05;P<0.05)；莫諾苷小劑量組患側(cè)海馬組織CyclinD1表達有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 各組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達情況注：#P<0.05與假手術(shù)組相比，*P<0.05與模型組相比Fig.1 The expression of CyclinD1 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

2.2 莫諾苷對患側(cè)海馬CDK6蛋白表達的影響

用Western blot 的方法檢測局灶性腦缺血大鼠患側(cè)海馬CDK6蛋白表達的情況。如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，莫諾苷中劑量組與大劑量組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達顯著降低(P<0.05;P<0.05)；莫諾苷小劑量組患側(cè)海馬組織CDK6表達有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 各組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達情況注：#P<0.05與假手術(shù)組相比，*P<0.05與模型組相比Fig.2 The expression of CDK6 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

3 討論

細胞周期是非常復(fù)雜而微妙的過程，細胞進入正常的細胞周期則進行正常的細胞分裂，而細胞進入異常的細胞周期則激活凋亡信號導(dǎo)致細胞死亡[8-9]。近期研究表明，在急性和慢性神經(jīng)退行性疾病中，細胞周期信號通路參與調(diào)控神經(jīng)細胞的死亡[10-11]。動物實驗和細胞實驗都證明，細胞周期的異常激活可以誘導(dǎo)caspase依賴的神經(jīng)元凋亡[12-13]。Chai等研究顯示，小檗堿可以抑制細胞周期蛋白CyclinD1的表達而抑制細胞凋亡[3]。此外，我們前期用免疫組化的方法檢測患側(cè)海馬細胞周期蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莫諾苷的神經(jīng)保護作用很有可能與其可以降低缺血性腦卒中大鼠患側(cè)海馬CA1區(qū)CyclinD1與CDK6的陽性細胞有關(guān)[14]。在該研究中我們用蛋白免疫印跡的方法，檢測局灶性腦缺血再灌注大鼠給藥7 d后患側(cè)海馬組織CyclinD1與CDK6的表達情況，進一步驗證了我們之前的研究結(jié)論。與前期研究結(jié)果一致，模型組與假手術(shù)組相比，CyclinD1及CDK6的表達顯著增加，導(dǎo)致缺血性腦損傷后進入異常細胞周期的細胞增多，與Wen等研究一致[15]，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡增加。給予莫諾苷后，與模型組相比，CyclinD1與CDK6的表達顯著降低，與前期研究結(jié)果一致，表明莫諾苷可以起到抑制腦缺血導(dǎo)致的CyclinD1和CDK6過量表達，從而抑制神經(jīng)細胞進入異常細胞周期，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，缺血性腦損傷會使細胞周期相關(guān)蛋白異常激活，導(dǎo)致分化末期的神經(jīng)細胞再次進入細胞周期，該過程可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡。通過藥物抑制細胞周期相關(guān)蛋白異常激活，阻止細胞進入異常的細胞周期很可能成為腦卒中的一個潛在治療靶點。