含黃油的高脂飼料誘導(dǎo)高脂血癥小鼠模型特征的研究*

李 靜 楊俐萍 朱順星 邵晶晶 劉玉山 陳旭東

(1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所中心實驗室，南通 226361)(2.南通大學(xué)實驗動物中心，南通 226001)(3.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，南通 226361)

高脂血癥(Hyperlipidemia)是血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)過高或血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)過低的一種全身脂代謝紊亂的疾病，是誘發(fā)動脈粥樣硬化、脂肪肝、心腦血管疾病等的主要危險因素之一，其中膽固醇的代謝紊亂與動脈粥樣硬化以及冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。隨著人類生活水平的提高，脂類物質(zhì)在膳食中的比例不斷增加，高脂血癥的發(fā)病率逐年攀升且趨于年輕化，嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量[3-4]。高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)是一種常見的高脂血癥，主要由肝臟膽固醇代謝紊亂引起。普遍認(rèn)為血中TC或LDL-C過高是誘導(dǎo)動脈粥樣硬化疾病的危險因子,是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要危險因子之一[5-6]。文獻資料報道，在發(fā)展中國家,心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐漸同發(fā)達國家居民相近,也是我國居民死亡的首要原因,中國每年有約300萬人死于心血管疾病[7]。因此研制具有改善血脂的藥物或保健食品對人類心腦血管健康有著重要意義，而高膽固醇血癥動物模型的建立，為篩選抗動脈粥樣硬化以及冠心病藥物的研究提供動物實驗基礎(chǔ)。

近年關(guān)于對高脂血癥動物模型建立的研究較多，資料表明，高脂血癥動物模型主要有先天性、轉(zhuǎn)基因和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等3種，其中高脂飼料喂養(yǎng)法相對而言操作簡便，為目前國內(nèi)常用方法[8]。應(yīng)當(dāng)指出的是，這些動物模型以血清中TC 和TG 均升高為特征，而且飼料中的脂肪成分是以豬油為主[9-12]。有資料表明，富含牛奶和黃油的飲食是高膽固醇血癥發(fā)生的主要因素[13]，黃油中的脂肪酸可以明顯提高血漿TC及LDL-C濃度[13-15]。在牛奶及黃油中含有豐富的飽和脂肪及膽固醇，攝入過多時可引起明顯的高膽固醇血癥[13-14]，從而導(dǎo)致冠心病。因此不難理解，為什么在西方國家認(rèn)為乳制品攝入量是與冠心病發(fā)病率相關(guān)的主要原因之一。基于上述資料，本研究通過建立單純的高膽固醇血癥的小鼠模型，采用在誘導(dǎo)飼料中添加黃油替代傳統(tǒng)方法中的豬油，觀察實驗小鼠血清TC，TG的變化特征，以及肝臟脂肪變性情況，為抗動脈粥樣硬化的降血脂藥物的研究提供動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠，來源于瑞典LUND大學(xué)實驗動物中心(2012年由段瑞冬教授饋贈)，經(jīng)中國海關(guān)安全檢查后入駐南通大學(xué)SPF動物中心，并飼養(yǎng)繁殖。該小鼠遺傳背景為C57BL/6，近交系，由南通大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(蘇)2014-0001]。動物的飼養(yǎng)繁殖以及實驗在南通大學(xué)實驗動物中心進行[SYXK(蘇)2012-0031]，并通過南通大學(xué)實驗動物倫理委員會的審批，批準(zhǔn)號為NTU-KO-2017-0228-001。

1.2 高脂飼糧(high fat diet，HFD)配方及供應(yīng)

基于已有報道高脂模型誘導(dǎo)飼料的配方，委托北京科澳協(xié)力飼料有限公司按以下成分及比例加工高脂飼料，黃油：15%，膽固醇：2%，玉米油：2%，奶粉：20%，蛋黃粉：10%，膽鹽：0.5%，基礎(chǔ)料：50.5%，其中膽固醇和蛋黃粉含量與文獻報道相近或相同[16-17]。

1.3 動物分組飼養(yǎng)及觀察指標(biāo)

取同窩雄性小鼠20只，鼠齡為4～6周，分別隨機分成2 組，每組10只，分別飼喂普通鼠糧(normal diet，ND)(不含黃油)和HFD。自由采食，自由飲水，實驗期為120 d。實驗過程中，每天觀察實驗小鼠外觀形態(tài)變化、采食行為及其對外界反應(yīng)等，每周測量小鼠體質(zhì)量，每4周檢測血中脂類濃度變化。在HFD喂養(yǎng)120 d后，處死小鼠并取材。

1.4 取材及檢測方法

采血：禁食12 h后行小鼠眼內(nèi)眥取血，取血量為每次80～100 μL/只，將小鼠全血置干燥管中，3 000 r /min離心10 min，保留上層血清，血清量為40～50 μL/只。每次取血結(jié)束后用無菌棉球按壓止血。上機檢測前用0.9%生理鹽水進行1∶1稀釋補足總量，最終血清學(xué)指標(biāo)數(shù)值=檢測值×稀釋倍數(shù)。采用日立7600全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)，總甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)的含量，其中TG和TC 含量采用液體雙試劑酶法檢測，HDL 和LDL 含量采用直接法檢測。

內(nèi)臟器官摘取：HFD喂養(yǎng)第120 d，給與小鼠禁食12 h后，采用麻醉機，給予小鼠七氟烷吸入性麻醉后，心臟取血 500～600 μL，3 000 r /min 離心10 min后，分離出上層血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。斷頸處死小鼠，摘取腹部脂肪、心臟、肝臟、脾臟和腎臟并稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù), 臟器系數(shù)=內(nèi)臟濕重/體質(zhì)量×100%。

肝臟病理學(xué)檢查：用預(yù)冷生理鹽水沖洗摘取的肝臟后，去除多余結(jié)締組織，濾紙吸干。在肝臟最大葉距邊緣5 mm 處取小塊肝組織用10%中性甲醛溶液固定，制作切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)變化。油紅O染色: 切片以蒸餾水漂洗后加入油紅O 染液15 min，用60%異丙醇漂洗1 min，即可鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兩組小鼠均未見死亡。HFD組小鼠毛發(fā)油亮，體型肥胖，行動稍緩慢(圖1右)。ND組小鼠毛發(fā)及體型正常，活動靈活(圖1左)。兩組小鼠飲食、糞便均正常。

2.2 體質(zhì)量的動態(tài)變化

從造模開始，動態(tài)記錄各組小鼠體質(zhì)量變化。造模開始后，HFD組小鼠體質(zhì)量持續(xù)上升，第50天開始HFD組小鼠體質(zhì)量與ND組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。第120天，HFD組小鼠體質(zhì)量增長是ND組的3倍，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量變化情況注：藍色代表正常飲食組小鼠增長曲線；紅色代表高脂飲食組小鼠增長曲線，高脂飼養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量增加值為同時間點的正常組值的倍數(shù)Fig.2 Changes of body weight in each groupNote:Blue represents the growth curve of mice in ND group；Red represents the growth curve of mice in HFD group. Increased fold of body weight in HFD group is based on the body weight of ND group

分組group0 d體質(zhì)量/g0 d weight/g120 d體質(zhì)量/g120 d weight/g質(zhì)量增加/gWeight gain/g正常飲食組ND group21.92±3.5725.28±4.163.36±1.21高脂飲食組HFD group20.91±0.5331.45±2.1610.54±1.80???

注：與正常飲食組比較，***P<0.001，n=10

Note：compared with ND group,***P<0.001,n=10

2.3 小鼠臟器系數(shù)變化

從表2可見，在120 d飼養(yǎng)后的小鼠， HFD組小鼠腹部脂肪質(zhì)量系數(shù)及肝臟質(zhì)量系數(shù)均顯著增加，與ND組相比的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，心臟、腎臟、脾臟器官的臟器系數(shù)均無明顯變化。

2.4 小鼠血脂變化

造模30 d時，HFD組小鼠血清TC開始上升，第120天血清TC增高水平明顯高于對照ND組，兩組比較的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表3)。其他血清學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示HFD組小鼠血清LDL值顯著高于對照組(P<0.001)，但是TG和HDL兩組都未檢測到升高變化(表3)。

表2 兩組小鼠臟器系數(shù)的變化Table 2 Changes in organ coefficient ofmice in each group

注：與正常飲食組比較，***P<0.001，n=4

Note：Compared with ND group,***P<0.001,n=4

表3 高脂飼料喂養(yǎng)120 d后小鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化Table 3 Changes in serum markers of micefed with HFD for 120 days

注：與正常飲食組比較，***P<0.001，n=10

Note：compared with ND group,***P<0.001,n=10

2.5 肝臟的病理學(xué)變化

肉眼觀察喂養(yǎng)小鼠120 d后的肝臟，可見ND組小鼠的肝臟呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性(圖3 A)，而HFD組小鼠的肝臟呈黃褐色，體積均勻性增大，肝臟質(zhì)地較硬，包膜緊張，邊緣鈍而厚，表面及切面呈灰黃色，有油膩感(圖3B)。HE染色后，ND組小鼠肝臟未見脂肪變性，小鼠肝細胞形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞中央有大而圓的核，無明顯脂肪滴，未見明顯的炎癥細胞(圖3C)。HFD組小鼠肝細胞核的相對大小不均，發(fā)生脂肪變性并伴有肝細胞壞死和炎性細胞浸潤(圖3D)。在油紅O染色后，ND組小鼠肝臟有少量的脂肪滴紅染(圖3E)，而HFD組小鼠肝臟有明顯的紅色脂肪滴(圖3F)。

圖3 高脂飼料誘導(dǎo)小鼠肝臟病理學(xué)變化注：A、C、E：正常飲食組小鼠肝臟外觀及病理學(xué)改變；B、D、F：高脂飲食組小鼠肝臟外觀及病理學(xué)改變。Fig.3 HFD induced pathological changes of liver in miceNote:A, C, E:Appearance and pathological changes of ND group mice liver; B、D、F：Appearance and pathological changes of HFD group mice liver

3 討論

高脂血癥誘發(fā)的心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類健康。高脂血癥本身引起的死亡并不多見，但在高脂血癥由于脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化、血液流變學(xué)異常、前列環(huán)素/血漿血栓素A2失衡[18]等情況時，易引起動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病[1-6, 18-19]。這些疾病的發(fā)生多與飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)，心腦血管疾病在西方人多發(fā)與他們以高脂高蛋白為主的飲食習(xí)慣有關(guān)[3,6]，而在我國特別是經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)以高脂飲食為主的飲食結(jié)構(gòu)已經(jīng)逐步取代了低脂高纖維飲食，也出現(xiàn)高脂血癥的發(fā)病率逐漸升高趨勢[4]。因此，尋找高脂血癥尤其是高膽固醇血癥的發(fā)病原因，探討高脂血癥的預(yù)防和治療，對人類健康有著深遠的意義。為此，建立高脂血癥特別是高膽固醇血癥的動物模型是一個重要的前提。

本研究立足于建立單純高膽固醇血癥動物模型，在傳統(tǒng)的高脂鼠料基礎(chǔ)上[16-17]，去除豬油成分而用牛奶制品黃油飼養(yǎng)小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)120 d含有牛奶黃油飼料喂養(yǎng)后，HFD組小鼠體質(zhì)量增長非常明顯，是ND喂養(yǎng)小鼠組體質(zhì)量增長的3倍。有意義的是，HFD組小鼠血中TC和LDL明顯升高，而TG及HDL無明顯改變。此外，HFD組小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性及炎性細胞浸潤。在我們的實驗?zāi)Ｐ统霈F(xiàn)黃油誘導(dǎo)小鼠的血脂變化是符合人類高膽固醇血癥形成的特點，即以TC和LDL升高為主。

黃油誘導(dǎo)肝臟脂肪變化和炎癥與高膽固醇血癥密切相關(guān)。機體攝入的膽固醇主要在肝臟中代謝，當(dāng)攝入過多膽固醇或各種原因引起的膽固醇在肝臟中代謝障礙，導(dǎo)致膽固醇在肝臟中蓄積，肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性[19-20]。本研究中，HFD對小鼠肝臟質(zhì)量影響明顯，并且其肝臟顏色呈灰黃色，提示肝臟細胞有大量脂肪沉積，經(jīng)HE染色后，可見HFD組小鼠肝臟被廣泛的脂滴占據(jù)，并伴有肝細胞壞死和炎性細胞浸潤。這些結(jié)果提示，過量攝入黃油引起高膽固醇血癥最終導(dǎo)致脂肪肝及非特異性肝炎。本研究表明，飼料中添加黃油飼養(yǎng)可以成功地建立高膽固醇血癥動物模型，其血脂變化是以TC，LDL明顯升高而TG沒有變化為特征，與人類高膽固醇血癥的體征相似，并且具有肝臟脂肪變性及炎性細胞浸潤的特點。本模型為高膽固醇血癥及脂肪肝的研究提供一個很好的動物模型。

致謝：本研究中使用的實驗小鼠來源于瑞典LUND大學(xué)實驗動物中心(2012年由段瑞冬教授饋贈)，感謝段瑞冬教授對本研究的悉心指導(dǎo)及無私幫助。感謝劉煥良及夏新龍給予的小鼠實驗操作的技術(shù)幫助。