健康甜菜根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究

桑雨菲

摘 要：甜菜是我國北方（包括西部）地區(qū)的重要糖料作物，當(dāng)前我國甜菜種植面積大概有20萬畝。連年的甜菜種植，出現(xiàn)的根腐病會直接導(dǎo)致甜菜含糖量降低，產(chǎn)量減少，嚴(yán)重時甚至絕產(chǎn)。生物防治甜菜根腐病作為環(huán)境友好型防治措施，正在被廣泛關(guān)注。針對目前尚缺乏對甜菜根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究，本研究采用稀釋涂平板分離方法，將采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧區(qū)健康甜菜的根際土樣中菌株進(jìn)行分離；通過16S rRNA的PCR擴(kuò)增測序，測出土壤中細(xì)菌；并利用進(jìn)化樹顯示出其親緣關(guān)系。共分離出30株細(xì)菌，鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，節(jié)桿菌屬1株，葉桿菌屬1株，綠膿桿菌屬1株，冢村氏菌屬1株，貪噬菌屬1株，黃桿菌屬1株。冢村氏菌屬細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU）最多；鏈霉菌屬菌株數(shù)量最多。希望能為生物防治甜菜根腐病提供一定依據(jù)，從而達(dá)到甜菜增產(chǎn)、農(nóng)民增收的目標(biāo)。

關(guān)鍵詞：甜菜根腐病；土壤根際細(xì)菌；菌株鑒定；PCR

中圖分類號：S435.663 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）22-0214-03

1 引言

甜菜是我國北方地區(qū)的重要糖料來源，也是世界上重要的糖料作物。甜菜有喜溫涼氣候，耐寒、耐旱、耐堿等特性。我國甜菜種植面積大概有20萬畝，主要分布在北緯40°以北各省區(qū)。在連年種植甜菜的產(chǎn)區(qū)，根腐病會使甜菜含糖量降低，產(chǎn)量減少10%-40%，嚴(yán)重時甚至絕產(chǎn)。由于甜菜根腐病帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，近年來越來越引起人們重視。甜菜根腐病可以由多種真核、原核病原菌引起，我國引起甜菜根腐病主要病原菌有鐮刀菌（Fusarium spp.）絲核菌（Rhizoctonia spp.）、絲囊菌（Aphanomyces spp.）胡蘿卜軟腐歐文氏菌甜菜亞種（Erwinia carotovora subsp.carotovora）和莖點屬真菌（Phoma spp.）等。土壤排水不良、板結(jié)、肥力不足，害蟲猖獗，甜菜重茬，根發(fā)育不良，人為造成傷口等都可能誘發(fā)甜菜根腐病。甜菜根腐病為土傳病害，因為引起該病的病原物多而復(fù)雜而且在病害大量發(fā)生以前很難察覺，因此防治起來有一定難度[1-2]。

通過選育抗病品種防治甜菜根腐病是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但現(xiàn)在國內(nèi)大部分地區(qū)還沒有可大面積推廣的高效抗病品種。農(nóng)業(yè)防治措施主要以預(yù)防為主，在根腐病發(fā)生時無法有效治理?；瘜W(xué)農(nóng)藥對甜菜根腐病防治有很好的效果，但有使病原菌產(chǎn)生抗藥性、造成環(huán)境污染、殺死土壤中有益微生物、威脅人類健康等缺點。生物防治是環(huán)境友好型防治措施，同時，因其對多種病原菌有效而引起廣泛關(guān)注。

近年來有一些關(guān)于甜菜根腐病的生防菌的研究：Webb的實驗表明菌株Hall and R47對復(fù)雜的土傳病害有一定防治作用并且可以增加甜菜產(chǎn)量[3]。Heidi等在溫室實驗中發(fā)現(xiàn)Trichoderma harzianum可以降低小麥和甜菜的猝倒病和根腐病[4]。Thilagavathi表明在盆栽實驗中Pseudomonas.fluorescens （Pf1）和T.asperellum（TTH1）聯(lián)合使用可以顯著減少由Sclerotium rolfsii引起的甜菜根腐病[5]，同時可以增加產(chǎn)量。但卻沒有研究指出健康甜菜土壤中細(xì)菌種類及其親緣關(guān)系。因此，我希望通過本研究能指出患甜菜根際土壤中細(xì)菌種類，并以進(jìn)化樹表示其親緣關(guān)系。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 土壤樣品

待測土壤實驗室自行分離保存（裝入密封袋，保存于4℃冰箱中），用于實驗的土樣采集于內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧區(qū)健康的甜菜田。

2.1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：量1L水于量杯中，稱取蛋白胨和NaCl各5g，牛肉浸膏3g（將稱量紙與牛肉浸膏一起放入量杯，在稱量紙破損前用玻璃棒挑出），葡萄糖2.5g，瓊脂18g，用pH計調(diào)酸堿度到中性。

2.1.3 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺、PCR儀、超低溫冰箱、海爾冰箱、渦旋振蕩器、30℃恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀、離心機、pH計、磁力攪拌器、瓊脂糖水平電泳槽。

2.2 方法

2.2.1 土壤中細(xì)菌的分離及保存

將土壤樣品用篩子篩，樣品進(jìn)行10-1到10-4梯度稀釋。在10ml離心管中稱1g土樣加9ml無菌水，充分震蕩混合。用移液槍吸1ml上述液體于離心管中再加9ml無菌水充分搖勻，重復(fù)該步驟2次。獲得10-4土壤樣品稀釋液，滴30μL于NA平板上，重復(fù)三次。用封口膜封口后放入30℃恒溫箱。待出現(xiàn)單菌落后，將長的不同的菌編上不同數(shù)字，并記錄各編碼菌CFU。用接菌環(huán)挑取有編號的菌，在NA平板上擴(kuò)繁。用封口膜封口后放入30℃恒溫箱，2-3天后平板上長出菌，將平板上的菌體用槍頭刮取，分別保存在二個加800μL30%甘油和800μL LB液體培養(yǎng)基的凍存管中，放入-80℃超低溫冰箱中保存。

2.2.2 菌液PCR

配制菌液：在超凈工作臺中，用槍頭蘸取少量菌體后，置于裝有20μL無菌水的PCR管中，晃動數(shù)下后拿出。

選用16S rRNA通用引物63F、1387R（引物序列見表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見表1。PCR反應(yīng)程序為：95℃10 min，94℃ 40s，55℃30s，72℃ 1 min30s，30個循環(huán)；最后 72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢驗，條帶正確后移送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的制作

將基因序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行比對，得到相近的菌種。在LPSN數(shù)據(jù)庫中，查找菌株的有關(guān)文獻(xiàn)及其系統(tǒng)進(jìn)化樹。將文獻(xiàn)中相近菌株的編號輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，得到相近菌的基因序列。將原菌、相近菌株的基因序列輸入軟件Mega5中，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果

3.1 測序結(jié)果

共30株菌株測序成功，得到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序報告——編碼16S rRNA的有關(guān)基因序列。

以B2B-15及其相關(guān)菌株為例（其余序列見附錄）：

>B2B-15_TSS20170828-010-5844.seq.Contig1

TTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTGGTTTTATGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTTTGTACCAGCCATTGTATGACGTGTGTAGCCCCACCTATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTACGGTTCTCTTTCGAGCACTAAGCCATCTCTGGCGAATTCCGTACATGTCAAAGGTGGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTTCGTTACTGAGTCAGTGAAGACCCAACAACCAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTACAGGCCCAGGGGATTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCATCCCCCTCTGCCGTACTCCAGCAATGCAGTCACAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACAACTGTCTTACATTACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTACGGTACCGTCATTAGCCCTCTTTATTAGAAAAGGCCGTTTCGTTCCGTACAAAAGCAGTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCCTGCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGAAGGCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTACCTAATCTGCCATCGGCCGCTCCATTCGCGCAAGGTCTTGCGATCCCCTGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAGCACAGCTTTCGCTGCGTTATCCCCCACGATTGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCC

3.2 培養(yǎng)菌落

在30℃恒溫箱培養(yǎng)三天后，觀察到菌落如圖1。

3.3 培養(yǎng)個數(shù)

在30℃恒溫箱培養(yǎng)三天后，觀察到不同菌株的個數(shù)如表3。

4 討論

本實驗將從土壤中分離的30株菌株進(jìn)行16S rRNA的PCR鑒定，為健康甜菜土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究提供參考依據(jù)，但僅僅局限于可培養(yǎng)細(xì)菌且分離的菌株較少。經(jīng)16S rRNA基因片段測序鑒定后表明：鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，其余屬各一株。從細(xì)菌菌落數(shù)量來看，冢村氏菌屬最多；從菌株種類來看，鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬數(shù)量多。其中，芽胞桿菌是一種比較理想的生防菌，其具有易分離、生長繁殖速度快等優(yōu)點。此外，芽孢桿菌有芽孢保護(hù)，具有較強抗不利環(huán)境條件的能力，對菌劑生產(chǎn)運輸要求低，且與化學(xué)農(nóng)藥混合使用或接觸時穩(wěn)定性好生存能力強。

5 結(jié)論與建議

5.1 結(jié)論

從土壤中分離并保存的30株菌株分布在8個屬中，其中，鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，節(jié)桿菌屬1株，葉桿菌屬1株，綠膿桿菌屬1株，冢村氏菌屬1株，貪噬菌屬1株，黃桿菌屬1株。從細(xì)菌菌落數(shù)量上看，B2B-1數(shù)量最多，屬冢村氏菌屬。

5.2 建議

根腐病對經(jīng)濟(jì)、環(huán)境都有巨大的害處。為減少這些危害發(fā)生，應(yīng)注重基礎(chǔ)研究，避免甜菜大面積減產(chǎn)、絕產(chǎn)，保障農(nóng)民的正常收入。在防治根腐病方面，應(yīng)避免化學(xué)制劑的過量使用，減少對土地、環(huán)境等危害，盡量進(jìn)行環(huán)境友好型的生物防治。

6 創(chuàng)新與展望

6.1 創(chuàng)新點

找出健康甜菜土壤中細(xì)菌種類，并做出進(jìn)化樹以表示其親緣關(guān)系。為甜菜根腐病的生物防治提供依據(jù)。

6.2 展望

由于本次研究時間較短，很多內(nèi)容還有待進(jìn)一步提升。本實驗中僅選取了內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧區(qū)甜菜根際土壤，若能增加取樣地點，可能會減少實驗誤差。

下一步，本研究希望通過拮抗試驗等方式找到甜菜根腐病的生防菌，如果條件允許，希望能制出微生物菌劑，使甜菜的生物防治應(yīng)用到農(nóng)田里，令農(nóng)民豐產(chǎn)豐收，生活富足。

7 致謝

首先感謝學(xué)校和科技俱樂部，給我這個機會，解答了我一直以來的問題，同時學(xué)到很多知識、技能，相信這在我今后的人生道路中會很有幫助。其次感謝我校內(nèi)的指導(dǎo)老師曹仁明老師，在我陷入低谷期的時候給予我鼓勵和幫助，感謝王琦老師及實驗室的師兄師姐，在專業(yè)知識上給予我很大幫助。

參考文獻(xiàn)

[1]Harveson R.M.， Hein G.L.， Smith J.A.， Wilson R.G.， Yonts C.D. 2002. An integrated approach to cultivar evaluation and selection for improving sugar beet profitability： a successful case study for the Central High Plains. Plant Disease，86：192-204.

[2]Harveson R.M.， Rush C.M. 2002.The influence of irrigation frequency and cultivar blends on the severity of multiple root diseases in sugar beets.Plant Disease，86：901-908.

[3]Webb， K.M.， Harveson， R.M. and West， M.S. 2015.Evaluation of Rhizoctonia zeae as a potential biological control option for fungal root diseases of sugar beet. Annals of Applied Biology，167（1）：75-89.