生長相關(guān)蛋白GAP-43多肽抗體的制備

姬志娟，盛樹力，王 蓉 ，趙志煒，張景艷，孟祥宏，張 旭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 中心實驗室，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

生長相關(guān)蛋白GAP-43多肽抗體的制備

姬志娟，盛樹力，王 蓉 ，趙志煒，張景艷，孟祥宏，張 旭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 中心實驗室，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

目的 對生長相關(guān)蛋白-43(growth associated proteins-43，GAP-43)進行抗原表位分析并制備兔多克隆抗體。方法 通過對GAP-43 cDNA序列及氨基酸序列的結(jié)構(gòu)進行生物信息分析，依據(jù)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、親水性、疏水性、抗原性及理化特性，經(jīng)過同源性檢索后，綜合考慮抗體設(shè)計的其他因素，選出具有免疫活性的抗原決定簇多肽片段，采用有機固相多肽合成法合成了GAP-43的多肽片段，并與載體蛋白血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)制備成抗原，免疫新西蘭家兔。結(jié)果 ELISA測定GAP-43抗體效價為1∶32 000;Western blot檢測結(jié)果顯示:在分子量25 kDa出現(xiàn)單一條帶;免疫組織化學(xué)法檢測顯示:GAP-43蛋白在小鼠海馬神經(jīng)元中有表達;免疫細胞化學(xué)法檢測顯示:GAP-43蛋白在人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y中存在表達。結(jié)論 利用生物信息學(xué)軟件比較準確地預(yù)測GAP-43的抗原決定簇，并成功制備了高效價、高特異性的多肽抗體。

生長相關(guān)蛋白-43;多肽合成;抗體制備

生長相關(guān)蛋白-43(growth associated proteins-43，GAP-43)是神經(jīng)元特異性磷蛋白，由238個氨基酸組成。目前已知其功能十分重要，是決定神經(jīng)元發(fā)育和再塑的內(nèi)在因素［1，2］。GAP-43 存在于軸突生長錐，因其在神經(jīng)損傷情況下表達顯著增加，常被作為研究神經(jīng)再生/再塑的分子標志物［3－5］。因此，制備抗GAP-43抗體對于分子水平上研究神經(jīng)損傷與再生具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant， IFA)，血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，四甲基聯(lián)苯胺購自美國 Sigma公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔的二抗和DylightTM488標記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈)購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

多肽自動合成儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI-431A型)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自日本Yamato公司，冷凍干燥儀購自美國 Virtis公司，新西蘭大白兔購自北京富豪實驗動物研究所，合格證號SCXK(京)2005-0009，高效液相色譜(HPLC)購自美國 Waters公司，酶聯(lián)儀購自法國巴斯德公司。

1.2 多肽抗原表位設(shè)計

根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)提供的公共數(shù)據(jù)庫和軟件對GAP-43蛋白進行抗原表位分析。小鼠的GAP-43蛋白由227個氨基酸組成，大鼠226個氨基酸組成，人是由238個氨基酸組成，等電點為4.64，利用計算機生物分析軟件分析GAP-43的氨基酸序列以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、抗原性、親水性、疏水性、結(jié)合位點及氨基酸的帶電性等，設(shè)計一段15個氨基酸的多肽。將設(shè)計好的多肽再返回到蛋白數(shù)據(jù)庫中進行匹配，檢測該序列的特異性。

1.3 多肽抗原制備

采用有機固相合成法合成多肽，固相載體用HMP樹脂，保護氨基酸采用 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony，)保護的氨基酸，從多肽羧基端向氨基端合成，用TFA法裂解肽樹脂，經(jīng)減壓蒸餾和乙醚萃取等方法處理后而得到粗品多肽。再用高效液相反相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)進行純化，純化后的樣品再用HPLC分析，純度為95%。將純化后的多肽冷凍抽干。

取純化后的多肽與血藍蛋白偶聯(lián)，偶聯(lián)方法是用碳化二亞胺法［1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，EDC］進行縮合反應(yīng)，得到多肽-血藍蛋白偶聯(lián)物(免疫原)。

1.4 GAP-43多肽抗體制備

新西蘭大白兔2只，雄性，經(jīng)過檢疫無病原菌的一級動物，體重為1.5 kg左右，免疫前行耳靜脈采血分離血清，凍存作為陰性對照血清。

基礎(chǔ)免疫:取多肽抗原-KLH 2 mg/mL與等量CFA充分乳化后于兩只兔背部皮下多點注射，每次免疫的抗原量約1000 μg/只。

加強免疫:第1次免疫后間隔2～3周，再以1 mg/1mL抗原加等體積的IFA充分乳化后注入兔背部皮下多點加強免疫。而后每隔2周按第二次免疫法重復(fù)加強免疫5～6次。每次免疫后的第10～14天，從兔耳靜脈采血測定抗體效價，直至獲得滿意的抗體效價后，行頸動脈插管取血，分離血清。

1.5 ELISA檢測多肽抗體效價

將GAP-43多肽溶于0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液，濃度為 2 μg/mL，每孔 100 μL包被酶標板，4℃過夜，1×PBS-T洗滌，加1%BSA的PBS封閉緩沖液，37℃溫育(incubation)1 h，封閉，1×PBS-T洗滌。同時將兔抗血清稀釋成:1∶500;1∶1000;1∶2000;14 000;1∶8000;1∶16 000;1∶32 000不同濃度，每孔加 100 μL，37℃ 孵育半小時，1× PBS-T洗滌并吸干全部液體，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h洗滌，加入顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色劑 A和 B液各100 μL/孔，避光顯色10 min，加終止液2 mol/L硫酸50 μL，450 nm處測定其A值。

1.6 多肽抗體純化

硫酸銨鹽析法:硫酸銨鹽析須經(jīng)過多次沉淀，第一次用40%飽和度，第二次用35%飽和度，第三次用33%飽和度，經(jīng)三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。再經(jīng)離子交換層析法提取 IgG。離子交換劑用的是DEAE纖維素-52。經(jīng)酸處理并在0.05 mol/L pH 7.5～8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡，將水分抽干，稱濕重1 g加于10mL血清中，在室溫30 min后，離心或過濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG，純度95%。

1.7 多肽抗體特異性鑒定

1.7.1 Western blot:將大鼠脊髓組織蛋白裂解液與上樣緩沖液混合，變性，進行12%SDS-PAGE，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)膜效果及有無氣泡。將膜置于5% 脫脂奶粉封閉，按1∶4 000加入GAP-43多肽抗體，后續(xù)步驟按Western blot印跡常規(guī)方法溫育二抗(1∶3 000)，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.7.2 免疫組織化學(xué):取正常小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，投入含30%蔗糖的多聚甲醛后固定液中，24 h換新的后固定液，4℃保存。

將腦標本從后固定液中取出，行冠狀面冰凍切片，厚度40 μm，待海馬出現(xiàn)后，保留切片。GAP-43多肽抗體免疫組織化學(xué)染色:將切片置于3%H2O2室溫孵育10 min，10%封閉用山羊血清室溫30 min，加入稀釋好的GAP-43抗體(1∶3000～9000)，室溫2 h，4℃孵育過夜。加入生物素標記的羊抗兔抗體(二抗，稀釋度為1∶300)，室溫孵育2 h。加入 HRP標記的抗生物素抗體(三抗，稀釋度為1∶300)，室溫孵育2 h。用DAB工作液顯色2 min左右，鏡下觀察染色背景，終止顯色反應(yīng)。

1.7.3 免疫細胞化學(xué):人神經(jīng)母細胞瘤株SHSY5Y細胞來自瑞典卡羅琳斯卡研究所，細胞培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d傳代1次，中間換液1次。

采用免疫熒光化學(xué)方法進行檢測:將細胞以1×104密度接種于35mm培養(yǎng)皿，3 d后待細胞形態(tài)飽滿、軸突伸長，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min。加入 GAP-43多肽抗體(1∶2000～6000)4℃過夜，熒光標記的羊抗兔IgG(1∶300)2 h，熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.7.4 多肽抗原吸收實驗:用多肽片段100 μg與抗體(1∶1000稀釋)結(jié)合，37℃反應(yīng)30 min后，進行ELIAS檢測(方法同1.5)。

2 結(jié)果

2.1 ELISA試驗檢測抗體效價

ELISA檢測GAP-43兔多肽抗體效價顯示，抗體滴度可達1∶32 000以上。說明該抗體靈敏度較高，可滿足實驗需要。

2.2 多肽抗體的特異性檢測

2.2.1 Western blot結(jié)果顯示，在25 kDa處有一條明顯的特異性蛋白條帶，說明該抗體特異性識別GAP-43蛋白(圖1)。

圖1 大鼠脊髓GAP-43 Western blot結(jié)果Fig.1 Western blot results of GAP-43 in the rat spinal cord

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在小鼠的海馬神經(jīng)組織中可見GAP-43免疫反應(yīng)陽性細胞，細胞呈多角形，在細胞漿和突起中均有棕色陽性顆粒分布，說明GAP-43蛋白在神經(jīng)組織中有表達(圖2)。

2.2.3 免疫熒光細胞化學(xué)結(jié)果顯示，在人神經(jīng)母細胞瘤株SY5Y的細胞中可見GAP-43免疫反應(yīng)陽性細胞，細胞呈星形，在細胞漿和突起中均有明亮的陽性表達，而細胞核呈陰性表達，說明GAP-43蛋白在人神經(jīng)母細胞瘤株SY5Y的細胞中有表達(圖3)(圖2，3 見彩插 2)。

2.2.4 吸收實驗結(jié)果為陰性，證明GAP-43抗體為特異性抗體。

3 討論

隨著人類蛋白質(zhì)組計劃及后基因組計劃的深入開展，越來越多的新基因所編碼的蛋白質(zhì)功能亟待闡明，而抗體是研究蛋白質(zhì)功能必不可少的工具。在一個新的基因被成功克隆后，依據(jù)推導(dǎo)出的氨基酸序列人工合成活性多肽片段，制備抗多肽的抗體，再用于該基因和蛋白質(zhì)的功能研究是一個行之有效的手段［6］。

在天然蛋白質(zhì)分子中，肽鏈按一定的規(guī)律折疊形成空間結(jié)構(gòu)，其中某些肽段暴露于分子表面，而另一些肽段深藏于分子內(nèi)部，因此，并非所有的肽段都能形成有效的抗原決定簇，只有暴露于分子表面并形成一定空間結(jié)構(gòu)的肽段才能作為抗原表位，刺激抗體產(chǎn)生并與產(chǎn)生的相應(yīng)抗體結(jié)合［7］。本實驗正是應(yīng)用此原理，成功預(yù)測了GAP-43的多肽抗原表位，經(jīng)過與血蘭蛋白耦聯(lián)后制備成大分子抗原，免疫家兔，得到抗血清，經(jīng)ELISA試驗檢測抗體效價為大于1∶32 000，可以用于實驗研究。

除抗體的效價外，抗體與不同條件下抗原的結(jié)合能力及其特異性是檢測抗體質(zhì)量的另一標準。有些肽段形成的抗原決定簇在變性條件下會受到破壞，抗這些肽段的抗體將不能用于Western印跡，因此在制備抗人工合成多肽的抗體后有必要對其進行鑒定［7］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，自行制備的GAP-43多肽抗體能與變性后的大鼠脊髓組織中的GAP-43結(jié)合，在大約50 kDa的分子量部位出現(xiàn)單一條帶，這是由于GAP-43分子中含有大量酸性氨基酸對電泳行為造成影響［8］，說明該多肽抗體能與不同條件下的GAP-43抗原特異性結(jié)合;同時，經(jīng)小鼠海馬神經(jīng)組織的免疫組織化學(xué)染色，也見到免疫反應(yīng)陽性細胞，說明該抗體可以用于檢測在體組織的GAP-43蛋白質(zhì)表達情況。

總之，本課題組通過人工合成多肽抗原決定簇片段、免疫動物、制備抗血清的方法，成功得到可以用于實驗研究的GAP-43多肽抗體。

［1］Denny JB.Molecularmechanisms， biologicalactions， and neuropharmacology of the growth-associated protein GAP-43［J］.Current Neuropharmacology，2006，4:293－304.

［2］Marklund N，Bareyre MF，Royo CN，et al.Cognitive outcome following brain injury and treatment with an inhibitor of Nogo-A in association with an attenuated downregulation of hippocampal growth-associated protein-43 expression［J］.Neurosurg，2007，107(4):844－853.

［3］朱寧，馬駿，曾少舉，等.GAP-43，Netrin-1，Collapsin-1和Neuropilin-1在出生后小鼠小腦中的動態(tài)表達［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2009，36(6):750～760.

［4］付雙林，張劍濤，趙景偉，等.大鼠顱腦外傷后生長相關(guān)蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2009，22(7):643－646.

［5］鄒佳，李長清.腦缺血再灌注大鼠GAP-43和 RhoA蛋白表達及 NEP1240對其的影響.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，31(12):1177－1180.

［6］Reimer J，TurckF.Genome-wide mapping of protein-DNA interaction by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization(ChIP-chip).PartA: ChIP-chip molecular methods.Methods Molecular Biology，2010;631:139－160.

［7］Schroeder J， Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins.J Allergy Clinical Immunology，2010，125(2 Suppl 2):S41－52.

［8］段小莉，黃文晉，王百忍，等.GAP-43原核表達載體的構(gòu)建、表達及抗GAP-43單克隆抗體的制備［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2003，19(5):482.

Preparation of Growth Associated Proteins-43(GAP-43)Polyclone Antibody

JI Zhi-Juan，SHENG Shu-Li，WANG Rong，ZHAO Zhi-Wei，ZHANG Jing-yan，MENG Xiang-hong，ZHANG Xu
Central Laboratory，Key laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Xuanwu Hospital of Capital Medical University.Beijing 100053，China.

Objective To analyze the epitope of rat and mouse growth associated proteins-43(GAP-43)and prepare its polyclonal antibody.Methods The GAP-43 full-length sequence was analyzed by bioinformatics to detect the structure of amino acids and select its epitope.GAP-43 peptides fragment was synthesized by solid-phase peptide synthesis method and purified by HPLC.The peptide was conjugated with keyhole limpet hemocyanin(KLH)，and used to immunize rabbits.Results The antibody dilution was 1∶32000，determined by ELISA.Western blot showed high activity and specificity of the antibody.A single band of 25 kDa was detected.Immunocytochemical staining showed the expression of GAP-43 in hippocampus CA1 region in mice.Immunohistochemical staining showed the expression of GAP-43 in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y cells.Conclusion A GAP-43 antibody has been prepared successfully.

GAP-43;Peptide synthesis;Antibody，preparation;Mouse;Rat

2392-33

A

1671-7856(2010)08-0022-04

2010-04-25

圖2 小鼠海馬神經(jīng)組織GAP-43兔疫組化染色結(jié)果（抗體稀釋度1:2000）
Fig.2 Results of immunohistochemical staining of GAP-43 in the mouse hippocampus.(antibody dilution 1:2000)

圖3 人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y GAP-43兔疫熒光細胞化學(xué)染色結(jié)果（抗體稀釋度1:2000）
Fig.3 Results of immunofluorescence cytochemical staining of GAP-43 in the human blastoma cell line SH-SY5Y cells (antibody dilution 1:2000)

國家“十一五”863計劃“疫苗與抗體工程”(2006AA02A245);首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金(2007-3108);北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才計劃資助項目(2009-3-64)。

姬志娟(1957－)，主管技師，從事多肽合成、純化、抗體制備工作。

王蓉，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事神經(jīng)元退行性變的發(fā)病機理和防治策略研究。