丹參川芎嗪注射液對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能、腦水腫及神經(jīng)元凋亡的影響研究

張波，伍海軍，鐘志軍，錢(qián)朝智，王盛，陳楊，劉昕，鄧進(jìn)，劉健，溫權(quán)，甘元華

腦出血屬中醫(yī)學(xué)“卒中”范疇，指風(fēng)陽(yáng)上竄、痰火內(nèi)擾、氣血逆亂致腦絡(luò)破損、血溢于腦，主要臨床表現(xiàn)為突然昏仆、頭痛、失語(yǔ)、偏癱等［1］。腦出血是導(dǎo)致患者肢體功能障礙及死亡的重要疾病之一，部分患者雖然幸存，但因神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷而出現(xiàn)肢體功能及語(yǔ)言功能障礙［2］。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，離經(jīng)之血便是瘀血、死血，故腦出血的治療關(guān)鍵是祛瘀，凡血證總以祛瘀為要，瘀血不去則出血不止、新血不生。丹參川芎嗪注射液為中藥復(fù)方制劑，主要由鹽酸川芎嗪、丹參素組成，主要功效為活血化瘀。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參川芎嗪注射液具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速紅細(xì)胞流速及改善微循環(huán)等作用［3］。本研究旨在探討丹參川芎嗪注射液對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能、腦水腫及神經(jīng)元凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2016年9月—2018年3月，72只清潔級(jí)健康SD大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1202318），22周齡，體質(zhì)量250～300 g，平均體質(zhì)量（282.0±4.5）g。

1.2 主要試劑及儀器 水合氯醛（武漢市和昌化工有限公司生產(chǎn)），多克隆水通道蛋白4（AQP-4）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）試劑、C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑（美國(guó)RD公司分裝），細(xì)胞凋亡試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)），免疫染色一抗、免疫染色二抗（碧云天，南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn)），丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20161031），TUNEL檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)RD公司分裝）。

1.3 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠分為假手術(shù)組、腦出血組及藥物干預(yù)組，每組24只。腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠采用兩次自體動(dòng)脈血注射法［4］構(gòu)建腦出血模型，以術(shù)后注射點(diǎn)無(wú)滲出及出血、大鼠出現(xiàn)相應(yīng)癥狀為腦出血建模成功；假手術(shù)組大鼠注入0.9%氯化鈉溶液50 μ1作為對(duì)照。3組大鼠均單獨(dú)給予清水及專(zhuān)用鼠食喂養(yǎng)，以保證營(yíng)養(yǎng)。藥物干預(yù)組大鼠于術(shù)后第2天開(kāi)始給予丹參川芎嗪注射液1.67 ml/kg〔半數(shù)致死量（61.5士5.3）mg/kg的半量換算后為1.67 ml/kg［5］〕腹腔注射，1次/d。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估方法 采用Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］評(píng)估3組大鼠術(shù)前及術(shù)后1、3、7、14 d神經(jīng)功能缺損程度，其中無(wú)神經(jīng)功能缺損記為0分，腦出血部位對(duì)側(cè)肢體出現(xiàn)屈曲狀態(tài)記為1分，行走轉(zhuǎn)圈記為2分，偏癱或行走時(shí)向出血對(duì)側(cè)傾倒記為3分，意識(shí)消失、完全不能行走記為4分；Zea Longa評(píng)分越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 VEGF檢測(cè)方法 3組大鼠均于術(shù)后1、3、7、14 d分別脫頸處死6只大鼠，取大鼠心臟血制備血清，采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清VEGF水平，主要步驟如下：室溫平衡20 min，取所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μl、再加樣本稀釋液40 μl；標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl（每孔），用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；排去液體，吸水紙吸干，每孔加滿(mǎn)洗滌液靜置1 min，排去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)上述洗板操作5次；加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；加入終止液50 μl，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

1.6 神經(jīng)元凋亡檢測(cè)方法 取大鼠心臟血制備血清后從前胸剪開(kāi)胸壁，于左心室插入9號(hào)粗針頭并使針尖升至主動(dòng)脈，用紋氏鉗鉗夾、固定針頭，剪開(kāi)右心房快速灌注0.9%氯化鈉溶液（常溫）150 ml，待血液顏色變清、肝臟變白后灌注4%多聚甲醛（4 ℃）400 ml；先快后慢，直至肢體和肝臟變硬，肝臟變蒼白后停止灌注；斷頭，解剖取所需腦組織制作解剖切片。采用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況，每組術(shù)后1、3、7、14 d隨機(jī)取3張切片，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)不相同的觀察視野，計(jì)數(shù)神經(jīng)元凋亡數(shù)量。

1.7 AQP-4檢測(cè)方法 采用免疫組化染色法檢測(cè)腦組織AQP-4表達(dá)情況，具體步驟如下：脫蠟、水化腦組織切片，蒸餾水漂洗，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中；3%過(guò)氧化氫（H2O2）阻斷10 min，蒸餾水漂洗，置于PBS中10 min；一抗孵育過(guò)夜，2 min內(nèi)采用PBS漂洗3次，IvisionTM二抗試劑HRP標(biāo)記羊抗鼠/兔通用型，2 min內(nèi)采用PBS漂洗3次，DAB顯色，光鏡控制；水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。每組術(shù)后1、3、7、14 d隨機(jī)取3張切片，在圖像分析光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取圖像（1:400），以胞膜、胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)取6個(gè)不相同觀察視野，使用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值作為AQP-4相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zea Longa評(píng)分 3組大鼠術(shù)前Zea Longa評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d Zea Longa評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d Zea Longa評(píng)分高于假手術(shù)組，藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后7、14 d Zea Longa評(píng)分低于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量3組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d血清VEGF水平及術(shù)后1、3、7 d腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組，腦出血組大鼠術(shù)后14 d腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后7、14 d血清VEGF水平高于腦出血組，腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量低于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

2.3 神經(jīng)元凋亡數(shù)量 3組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d神經(jīng)元凋亡數(shù)量多于假手術(shù)組，藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后3、7、14 d神經(jīng)元凋亡數(shù)量少于腦出血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

表2 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Table 2 Comparison of serum VEGF level and relative expression quantity of AQP-4 in brain tissue in the three groups at different time points after operation

表1 3組大鼠手術(shù)前后Zea Longa評(píng)分比較（x±s，分）Table 1 Comparison of Zea Longa score in the three groups before and after operation

表3 3組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較（x± s，個(gè)/視野）Table 3 Comparison of number of apoptotic neurons in the three groups at different time points after operation

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，出血性中風(fēng)是由氣火上沖犯腦、絡(luò)破血溢所致，血溢脈外，瘀阻于腦中，形成腦中“蓄血癥”，主要表現(xiàn)為清竅阻塞、嘴唇不直、偏癱異常；而血水同源、血水互生又可使氣血雍滯，血不利則為水，故形成腦中“蓄水癥”［7］。腦出血后局部血腫形成引起顱內(nèi)壓急性升高，壓迫周?chē)X組織，造成血液循環(huán)障礙、中央部分細(xì)胞凋亡或壞死；在缺血再灌注過(guò)程中，氧自由基的大量形成及脂質(zhì)過(guò)氧化的增加又導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷加重［8-9］。因此，血流停滯不僅導(dǎo)致瘀血停滯，還會(huì)導(dǎo)致再出血，進(jìn)而加重腦組織損傷［10］。

丹參川芎嗪注射液為中藥復(fù)方制劑，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速紅細(xì)胞流速及改善微循環(huán)等作用［3］；此外，其還能快速透過(guò)血-腦脊液屏障并在腦組織中持久存在。蔣西亞［11］、梁勇［12］研究表明，活血化瘀法能有效改善高血壓腦出血患者神經(jīng)功能，提高患者臨床療效。易智峰等［3］研究表明，丹參川芎嗪注射液能有效促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕病灶占位效應(yīng)，緩解病灶周?chē)凸嘧顟B(tài)，進(jìn)而減少缺血半暗帶。張波等［13］研究表明，丹參川芎嗪注射液能有效減輕高血壓動(dòng)脈粥樣硬化性腦出血患者腦水腫，減少缺血半暗帶，改善腦功能。

本研究結(jié)果顯示，腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d Zea Longa評(píng)分高于假手術(shù)組，藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后7、14 d Zea Longa評(píng)分低于腦出血組，提示腦出血大鼠存在神經(jīng)功能缺損，而丹參川芎嗪注射液能有效改善腦出血大鼠神經(jīng)功能。VEGF是一種具有血管形成和血管通透性的細(xì)胞因子［14］，具有刺激血管形成、保護(hù)神經(jīng)元等作用［15］。AQP-4屬于水特異性通道蛋白，在腦組織中含量最高，對(duì)維持顱內(nèi)水平衡具有重要作用［16］。張波等［17］研究表明，VEGF和AQP-4可能參與腦出血后腦水腫的形成與消退。本研究結(jié)果顯示，腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d血清VEGF水平及術(shù)后1、3、7 d腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組，腦出血組大鼠術(shù)后14 d腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組；藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后7、14 d血清VEGF水平高于腦出血組，腦組織AQP-4相對(duì)表達(dá)量低于腦出血組，提示腦出血大鼠存在腦水腫，而丹參川芎嗪注射液能有效減輕腦出血大鼠腦水腫；分析其原因可能為丹參川芎嗪注射液能有效改善微循環(huán)，增加腦灌注及局部代謝，清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少局部炎性遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物，進(jìn)而改善能量代謝、提高三磷腺苷（ATP）酶活性、降低興奮性氨基酸含量及膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)、減少膠質(zhì)細(xì)胞含水量，最終抑制腦水腫。既往研究表明，血腫被免疫細(xì)胞分解并釋放有害物質(zhì)可引起腦水腫、炎性反應(yīng)并激發(fā)神經(jīng)元凋亡程序［18］。本研究結(jié)果顯示，腦出血組和藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后1、3、7、14 d神經(jīng)元凋亡數(shù)量多于假手術(shù)組，藥物干預(yù)組大鼠術(shù)后3、7、14 d神經(jīng)元凋亡數(shù)量少于腦出血組，提示腦出血大鼠存在神經(jīng)元凋亡，而丹參川芎嗪注射液能有效抑制腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡；分析其主要機(jī)制可能為AQP-4減少了白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細(xì)胞因子釋放，使內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)升高［19］，誘發(fā)VEGF增加，促進(jìn)局部小血管生成，減輕腦水腫及炎性反應(yīng)，降低Caspase-3表達(dá)、增加Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡［20］。

綜上所述，丹參川芎嗪注射液能有效改善腦出血大鼠神經(jīng)功能，減輕腦水腫，抑制神經(jīng)元凋亡。但本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，丹參川芎嗪注射液治療腦出血的臨床效果及機(jī)制仍需大量臨床研究進(jìn)一步探究。

作者貢獻(xiàn)：張波、伍海軍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；張波、伍海軍、鐘志軍、錢(qián)朝智、王盛、陳楊、劉昕進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；鐘志軍、錢(qián)朝智、王盛、溫權(quán)、甘元華進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張波進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)瑢?duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；鄧進(jìn)、劉健負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。