外泌體在心血管疾病診療中的研究進(jìn)展

劉輝 綜述 王國(guó)干 審校

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國(guó)家心血管病中心阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037)

外泌體(exosome)是一種由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的磷脂雙分子層囊泡狀小體，內(nèi)含多種蛋白、脂類、信使核糖核酸/微小核糖核酸(mRNAs/miRNAs)等，參與細(xì)胞間通訊、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)等過(guò)程，從而發(fā)揮重要作用[1]。來(lái)源于不同細(xì)胞的外泌體其組成成分及功能不同，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。此外，外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，使其成為一種理想的靶向給藥載體。心血管疾病已經(jīng)成為危害人類健康的頭號(hào)殺手，發(fā)現(xiàn)一種新型的治療方式迫在眉睫，外泌體在心血管病領(lǐng)域的研究受到廣泛關(guān)注。

1 外泌體與細(xì)胞外囊泡

1.1 細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞分泌的膜性顆粒，為一組異質(zhì)性較大的亞細(xì)胞成分，包括膽固醇、鞘磷脂及磷脂酰絲氨酸等在內(nèi)的多種脂質(zhì)成分，并富含核酸及蛋白質(zhì)，幾乎所有細(xì)胞均可分泌細(xì)胞外囊泡[2]。細(xì)胞外囊泡的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1946年,Chargaff等[3]在31 000 g的條件下離心血漿，發(fā)現(xiàn)一種可以加速血栓形成的微粒。細(xì)胞外囊泡第一次被報(bào)道是在1967年，Wolf[4]通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)一種由血小板分泌的微粒，當(dāng)時(shí)命名為“platelet dust”。最初大家認(rèn)為，細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞用來(lái)清除代謝廢物的垃圾桶。近年來(lái)，細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)功能引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。隨著研究的深入，幾乎在所有的體液(如血液、尿液、唾液、腦脊液等)中均可檢測(cè)到細(xì)胞外囊泡。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞間物質(zhì)信號(hào)交換的一種重要方式，參與細(xì)胞增殖、分化及死亡等眾多病理生理過(guò)程[5]。根據(jù)細(xì)胞外囊泡的分子大小、生物來(lái)源及釋放方式的不同，將細(xì)胞外囊泡分為3個(gè)亞組：(1)來(lái)源自多泡小體胞吞融合的外泌體，直徑約為30～100 nm；(2)直接從細(xì)胞膜通過(guò)出芽方式產(chǎn)生的微囊泡，直徑約為100～1 000 nm；(3)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡產(chǎn)生的凋亡小體，直徑約為1 000～4 000 nm[6]。

1.2 外泌體

外泌體的形成首先是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成初級(jí)核內(nèi)體(endosomes)，然后核內(nèi)體膜進(jìn)一步內(nèi)陷形成多個(gè)腔內(nèi)囊泡，即為次級(jí)核內(nèi)體或多泡小體，多泡小體經(jīng)過(guò)溶酶體途徑后與細(xì)胞膜融合，以胞吐的方式分泌到細(xì)胞外即為外泌體[7]。外泌體這種特殊的形成方式使其特征性的高表達(dá)膜蛋白四分子交聯(lián)家族成員如CD81、CD82、CD63、CD9等，及其他類型的蛋白如細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)Alix、細(xì)胞質(zhì)蛋白Annexins、熱休克蛋白(Hsp90、Hsp70、Hsp60)等。此外，越來(lái)越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)外泌體富含脂質(zhì)(包括膽固醇、鞘磷脂及神經(jīng)酰胺等)和核酸(包括DNA、mRNA、miRNA 以及l(fā)ncRNA等)。細(xì)胞處于不同的病理生理?xiàng)l件下，其分泌的外泌體所包含的內(nèi)容物不同，因此外泌體可以反映細(xì)胞的狀態(tài)，這表明外泌體可能成為疾病診斷及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。外泌體既可以作用于臨近細(xì)胞，亦可通過(guò)體液循環(huán)作用于遠(yuǎn)距細(xì)胞。外泌體對(duì)靶細(xì)胞的作用主要通過(guò)3種方式：(1)與靶細(xì)胞膜融合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋放內(nèi)容物；(2)受體-配體相互作用；(3)靶細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用攝入外泌體。外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)及上述特性可能使其成為靶向給藥的理想載體[8]。

2 不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體在心血管病治療中的作用

近年來(lái)，干細(xì)胞治療心血管病被給予很高的期望，并取得一定的進(jìn)展。雖然移植干細(xì)胞在損傷心肌區(qū)域可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，形成微血管，以及分化為心肌細(xì)胞，從而起到治療效果；但是移植干細(xì)胞低的心肌歸巢和分化無(wú)法完全解釋治療獲益，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞治療獲益主要通過(guò)激活自身心肌干細(xì)胞、誘導(dǎo)血管新生、保護(hù)存活心肌以及抗炎抗纖維化等間接機(jī)制改善心功能。這些過(guò)程受移植干細(xì)胞產(chǎn)生的多種旁分泌因子、小分子、蛋白及mRNAs/miRNAs調(diào)控。干細(xì)胞分泌的外泌體可以有效轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAs/miRNAs和蛋白質(zhì)，被認(rèn)為在調(diào)控組織再生方面發(fā)揮重要作用[9]。不同干細(xì)胞分泌的外泌體具有不同生物學(xué)特點(diǎn)，因此可能產(chǎn)生不同的治療效果。包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSCs)及心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells,CPCs)在內(nèi)的多種干細(xì)胞來(lái)源的外泌體被認(rèn)為在心血管病的治療中有廣泛的前景。

2.1 ESCs和iPSCs來(lái)源的外泌體

ESCs可以分化為成人機(jī)體的任何類型的細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中具有重要的地位。與ESCs類似，iPSCs也具有分化為機(jī)體任何類型細(xì)胞的能力。二者雖然有強(qiáng)大的分化能力，但由于存在倫理、在心臟中低的歸巢和存活率以及定向分化差等原因，在心血管疾病中的應(yīng)用受限，而二者分泌的外泌體不存在這些問(wèn)題。iPSCs來(lái)源的外泌體也被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)血管新生、對(duì)損傷心肌存在保護(hù)作用[10-11]。Khan等[12]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于小鼠ESCs的外泌體通過(guò)促進(jìn)血管新生及心肌存活改善了急性心肌梗死小鼠的心功能。并發(fā)現(xiàn)miRNA-294可以促進(jìn)CPCs存活和增殖。包括miRNA-294在內(nèi)的miRNA-290家族的miRNA廣泛存在于ESCs來(lái)源的外泌體中。miRNA-291、miRNA-294及miRNA-295參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞周期。此外，在iPSCs來(lái)源的外泌體中發(fā)現(xiàn)含有miRNA-21和miRNA-210[10]，二者具有抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，這表明iPSCs來(lái)源的外泌體可以通過(guò)富含的miRNA起到保護(hù)損傷心肌的作用。

2.2 MSCs來(lái)源的外泌體

MSCs存在于如骨髓、臍血、皮下脂肪、骨骼肌等多種組織器官中的一種具有多能分化能力的干細(xì)胞。可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞等。包括骨髓來(lái)源的MSCs在內(nèi)的多種MSCs已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死與心力衰竭的治療中。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)移植到心臟的MSCs并沒(méi)有表現(xiàn)出強(qiáng)大的分化能力，通過(guò)靜脈注射的MSCs很少到達(dá)心臟，通過(guò)冠狀動(dòng)脈注射的MSCs在梗死區(qū)域無(wú)法長(zhǎng)期存活。這表明MSCs改善心臟功能是通過(guò)其旁分泌因子而不是直接分化為心臟細(xì)胞而起作用的。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)人臍血MSCs條件培養(yǎng)基可以抑制H9C2細(xì)胞凋亡[13]，也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，MSCs來(lái)源的外泌體作為轉(zhuǎn)運(yùn)心臟保護(hù)因子的媒介引起了廣泛的關(guān)注。Lai等[14]發(fā)現(xiàn)，由ESCs分化而來(lái)的MSCs分泌的外泌體可以減少缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積、改善心臟功能。并發(fā)現(xiàn)MSCs來(lái)源的外泌體可以減少氧化應(yīng)激，激活蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶-3，抑制c-Jun氨基末端激酶，同時(shí)還有抗炎癥反應(yīng)的作用。MSCs來(lái)源的外泌體還被發(fā)現(xiàn)富含miRNA-19、miRNA-21、miRNA-22，抑制凋亡、促進(jìn)血管新生，減少梗死面積，改善心臟功能[15-17]。

2.3 HSCs來(lái)源的外泌體

HSCs具有高度自我更新能力，可分化為各類血細(xì)胞的祖細(xì)胞。同其他細(xì)胞一樣，HSCs也可以分泌包括外泌體在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡，HSCs分泌的細(xì)胞外囊泡主要被分泌到骨髓中，也可以滲透入外周血液循環(huán)中[18]。HSCs來(lái)源的外泌體參與細(xì)胞間通訊，被認(rèn)為可以成為反映骨髓環(huán)境的生物標(biāo)志物，并具有預(yù)防和治療包括心血管病在內(nèi)的多種疾病的潛力。有研究表明，心肌內(nèi)注射骨髓來(lái)源的細(xì)胞可以改善心肌梗死小鼠的心室功能，而這一保護(hù)效應(yīng)無(wú)法用直接分化為心肌細(xì)胞解釋，而可能是通過(guò)旁分泌途徑激活心臟內(nèi)源性的祖細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[19]。CD34是HSCs的主要標(biāo)志物，CD34+細(xì)胞來(lái)源的外泌體比其他細(xì)胞富含更多的miRNA-126，而miRNA-126具有促進(jìn)血管新生的作用[20]。然而，目前只有一些間接證據(jù)表明HSCs來(lái)源的外泌體具有心臟保護(hù)作用，尚缺乏直接證據(jù)。

2.4 CPCs來(lái)源的外泌體

根據(jù)生物標(biāo)志物和形態(tài)的不同，CPCs可分為Sca1+、c-kit+、心肌球源性干細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)以及心肌球(cardiospheres，CSPs)。由于CPCs來(lái)源于心臟本身，可以激活內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，相比于其他干細(xì)胞具有更強(qiáng)的心臟再生潛能。包括動(dòng)物模型和臨床在內(nèi)的多個(gè)研究表明，CPCs注射可以改善梗死心肌的心臟功能[21-22]，并且心肌細(xì)胞和血管數(shù)量均明顯增加。然而，同其他干細(xì)胞一樣，在心肌中的移植成活率很低，這表明CPCs也是通過(guò)旁分泌效應(yīng)發(fā)揮心臟保護(hù)作用的。CPCs來(lái)源的外泌體含有多種蛋白、生長(zhǎng)因子、mRNA以及miRNA等。研究表明，通過(guò)注射CPCs來(lái)源的外泌體可以減少心肌細(xì)胞死亡，改善心肌梗死小鼠的心臟功能[21,23]。進(jìn)一步研究表明，CPCs來(lái)源的外泌體富含miRNA-21、miRNA-132、miRNA-146a以及miRNA-210，通過(guò)調(diào)節(jié)下游的目的蛋白程序性細(xì)胞死亡因子4、促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體配體A3和蛋白酪氨酸磷酸酶1B等，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移[21,24]。

3 外泌體作為生物標(biāo)志物在心血管病診斷中的作用

由于在不同生理病理?xiàng)l件下，外泌體的數(shù)量及內(nèi)容物可以發(fā)生改變，并且外泌體在血液、尿液、唾液等體液中均可檢測(cè)到。因此外泌體及其包含的脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等可以用于幫助心血管病的診斷。Kuwabara等[25]對(duì)比了急性冠脈綜合征的患者與正常人血清中miRNA-1和miRNA-133a的水平，發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者血清中的miRNA-1和miRNA-133a較正常人明顯升高，而miRNA-133a可以通過(guò)外泌體進(jìn)入血液循環(huán)。心力衰竭患者中特異的外泌體miRNA差異性改變使其有幫助診斷心力衰竭的潛力。Matsumoto等[26]分析了377例心肌梗死后心力衰竭患者血清中miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血清外泌體中P53途徑相關(guān)的miRNA，如miRNA-192、miRNA-194及miRNA-34a的表達(dá)明顯升高，他們認(rèn)為外泌體中的miRNA-192、miRNA-194及miRNA-34a可以被視為心肌梗死后心力衰竭的預(yù)測(cè)因子。循環(huán)中外泌體miRNA也被認(rèn)為可能成為與心血管疾病密切相關(guān)的代謝綜合征的新型生物標(biāo)志物。Karolina等[27]研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征患者循環(huán)中miRNA-17、miRNA-197、miRNA-509-5p、 miRNA-92a以及miRNA-320a的水平明顯增高。其中2型糖尿病的患者僅有miRNA-320a的水平升高。而高血壓患者miRNA-197、miRNA-92a水平升高，miRNA-17、miRNA-509-5p及miRNA-320a水平降低。這表明循環(huán)中特異的miRNA改變可以反映代謝綜合征不同的病理狀態(tài)。

除miRNA外，外泌體中包含的蛋白也被認(rèn)為具有心血管疾病的預(yù)測(cè)作用。大量研究表明，缺氧條件下，外泌體中蛋白的水平明顯改變[28]，而缺氧是冠心病的基本病理過(guò)程。Cheowet等分析了心肌梗死與穩(wěn)定型心絞痛患者的血漿細(xì)胞外囊泡蛋白的情況，發(fā)現(xiàn)兩組患者252種細(xì)胞外囊泡蛋白存在差異，其中與心肌梗死進(jìn)程密切相關(guān)的蛋白如補(bǔ)體成分1q子成分A、補(bǔ)體C5、載脂蛋白D、載脂蛋白C-Ⅲ、血小板糖蛋白1b α鏈、血小板堿性蛋白在心肌梗死組明顯升高[29]。這預(yù)示外泌體蛋白有可能成為診斷心肌梗死的生物標(biāo)志物。

目前，外泌體作為生物標(biāo)志物在心血管病中的研究尚少，但隨著研究的深入，相信其在臨床診斷心血管病中的應(yīng)用具有廣闊的前景。

4 展望

隨著藥物和手術(shù)治療的不斷發(fā)展，心血管病的治療已經(jīng)取得很大的進(jìn)展。然而，心血管病患者的遠(yuǎn)期預(yù)后和生存率仍不理想。干細(xì)胞移植治療心血管病的有效性已在大量的基礎(chǔ)及臨床研究中得到證實(shí)，但是仍存在免疫排斥、倫理、移植細(xì)胞在損傷心肌生存率低等問(wèn)題。起初人們認(rèn)為，干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞、促進(jìn)心肌的修復(fù)和再生，然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)只有很少的心肌細(xì)胞來(lái)自移植細(xì)胞的分化，于是旁分泌機(jī)制被發(fā)現(xiàn)并引起學(xué)者的重視。外泌體被認(rèn)為是一種新穎的并且具有巨大潛力的治療心血管病的方法。雖然外泌體的研究尚處于起步階段，仍存在許多問(wèn)題需要解決，如目前的外泌體的提取方法無(wú)法得到高純度、高濃度的外泌體，仍存在一定的免疫排斥反應(yīng)，遠(yuǎn)期的有效性及安全性尚不明確。然而，外泌體包含多種脂質(zhì)、核酸及蛋白，在細(xì)胞間通訊中扮演著重要的角色，在心血管病的生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，這預(yù)示著外泌體廣闊的治療前景。外泌體存在于所有的體液中，不同生理病理?xiàng)l件下，外泌體的數(shù)量及內(nèi)容物會(huì)發(fā)生改變，穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可以保護(hù)內(nèi)容物免受破壞，這些特點(diǎn)使其具有成為生物標(biāo)志物的潛力，可以更早更準(zhǔn)確地反映疾病的進(jìn)程。隨著研究的不斷深入，上述問(wèn)題得到解決，相信外泌體可以成為治療心血管疾病的有力武器，而在這之前，還需要做大量的基礎(chǔ)及臨床研究。