Wnt3a與Wnt5a信號(hào)途徑轉(zhuǎn)換對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

李 雙，孫倩倩，余麗梅*，趙春華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 遵義 563003；2.貴州省羊膜與骨髓干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì), 貴州 遵義 563003； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織工程研究中心 干細(xì)胞新藥研發(fā)及臨床轉(zhuǎn)化研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

衰老(aging or senescence)通常是指生物體發(fā)育成熟后，正常情況下隨著年齡的增加，體內(nèi)各器官、組織和細(xì)胞逐步發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的、全面的結(jié)構(gòu)和功能衰退，并且隨著進(jìn)程推移和不斷發(fā)展，出現(xiàn)不可避免的機(jī)體死亡[1]。衰老過(guò)程中的變化主要體現(xiàn)在機(jī)體組織細(xì)胞和構(gòu)成物質(zhì)喪失，代謝率減緩，組織器官功能減退，如造血免疫功能衰退等，表現(xiàn)出血細(xì)胞數(shù)量和比例改變，免疫細(xì)胞分化偏移，機(jī)體免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)功能降低等，從而導(dǎo)致衰老相關(guān)疾病如腫瘤、感染等發(fā)生明顯增加。衰老的機(jī)制除涉及氧化應(yīng)激、DNA損傷、蛋白質(zhì)組穩(wěn)態(tài)改變、線粒體功能失調(diào)、細(xì)胞微環(huán)境變化、端?？s短與端粒酶活性降低外，還與下丘腦—性腺—性激素功能平衡紊亂和表觀遺傳學(xué)改變及免疫炎性反應(yīng)等有關(guān)[2- 5]。越來(lái)越多的研究表明，機(jī)體衰老的實(shí)質(zhì)為干細(xì)胞衰老，造血干細(xì)胞(haematopoietic stem cell，HSCs)衰老為其主要原因之一；顯然，延緩或阻止HSCs等成體干細(xì)胞衰老，不但可維持機(jī)體的正常功能，還可減少相關(guān)疾病的發(fā)生；深入了解 HSCs 衰老的分子調(diào)控機(jī)制，不僅有助于HSCs 數(shù)量及功能穩(wěn)態(tài)的維持，對(duì)理解 HSCs 衰老及其相關(guān)疾病的發(fā)生亦非常重要，對(duì)于發(fā)現(xiàn)HSCs 衰老及其相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)、研發(fā)治療新策略都十分有益，因此，本文主要綜述了HSCs衰老的生物學(xué)特征和功能變化，并重點(diǎn)闡述了非經(jīng)典Wnt3a通路向經(jīng)典Wnt5a通路轉(zhuǎn)換對(duì)HSCs衰老的影響及調(diào)控機(jī)制。

1 HSCs衰老的主要表現(xiàn)與影響因素

HSCs 具有自我更新和多譜系分化潛能，是造血、免疫組織器官保持年輕的重要基石。與年輕小鼠比較，老年鼠骨髓中向髓系分化的HSCs比例增高，而向淋系分化的HSCs比例下降，HSCs的自我更新能力下降；Lin-Sca- 1+Kit+CD34low/-Flk2-HSCs的長(zhǎng)期增殖潛能明顯降低。移植試驗(yàn)中，衰老的HSC骨髓歸巢能力下降，出現(xiàn)明顯延遲的增殖反應(yīng)，從而表現(xiàn)出貧血、免疫功能衰退等造血系統(tǒng)衰老的特征性表現(xiàn)[4]，這也較好地解釋了老年個(gè)體易患感染類疾病、免疫力低下及免疫接種成功率低的緣由。

諸多研究表明，衰老過(guò)程中造血系統(tǒng)的基本成分得以維持，但HSCs的數(shù)量和質(zhì)量卻逐漸降低，HSCs衰老主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大，自我更新能力減弱和分化功能異常，黏附能力增加，HSCs歸巢至骨髓能力減弱，遷移到外周血能力增強(qiáng)；凋亡和細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性顆粒增加，細(xì)胞增殖周期阻滯，可逆地停留于G1期；機(jī)體的免疫系統(tǒng)包括淋巴細(xì)胞功能下降，甚至表現(xiàn)出骨髓衰竭、貧血、免疫力低下，乃至產(chǎn)生白血病等衰老相關(guān)疾病，并可見(jiàn)Wnt、FGF、p16INK4a和SIRT6等重要信號(hào)分子表達(dá)的改變[6]。

除了復(fù)制性衰老，DNA 損傷累積可導(dǎo)致HSCs 衰老及其功能下降[7]；端粒酶基因敲除小鼠的HSCs 體外克隆形成能力和體內(nèi)造血重建能力均顯著下降，提示端?？s短也可影響HSCs的自我更新能力；但端粒酶與p21 雙基因敲除后， p21 基因表達(dá)的降低可以改善HSCs 的自我更新能力[8]。在HSCs 衰老與抗衰老的過(guò)程中，構(gòu)成HSCs 微環(huán)境的局部細(xì)胞因子如干細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子、促血小板生成素及Notch 信號(hào)、血管生成素、Wnt信號(hào)分子等都參與了HSCs增殖、分化及衰老的發(fā)生、發(fā)展[9]。此外D-半乳糖、白消安、間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代、放射性損傷等都可誘發(fā)HSCs衰老，也可能涉及HSCs自身的基因突變及表觀遺傳學(xué)改變[10]。

2 Wnt信號(hào)通路

在HSCs及非造血的基質(zhì)細(xì)胞中，有豐富的Wnt家族成員的表達(dá)，經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的激活都可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡、遷移及細(xì)胞極性改變等生物學(xué)行為及其細(xì)胞命運(yùn)決定[11]。在經(jīng)典Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路中，Dally/Kny可促進(jìn)Wnt的招募，Wnt與Frizzled(Fz)受體和LRP5/6受體結(jié)合，F(xiàn)z結(jié)合Dvl，經(jīng)GSK3和CK1γ和CK1等，F(xiàn)z-LRP6復(fù)合物中LRP6磷酸化，促進(jìn)Axin招募，并與去磷酸化β-catenin結(jié)合，穩(wěn)定的β-catenin集聚增加，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，LEF/TCF)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)下游如c-myc、cyclin D1等靶基因轉(zhuǎn)錄。cyclin D1是細(xì)胞周期增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，為細(xì)胞周期從G1期到S期轉(zhuǎn)換所必須，當(dāng)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核與LEF/TCF結(jié)合，激活cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖。c-myc基因的轉(zhuǎn)錄水平反應(yīng)組織細(xì)胞的增殖狀態(tài)，其啟動(dòng)子上有TCF4結(jié)合位點(diǎn)，能與β-catenin結(jié)合，從而加速G1到S期的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞分化增殖，同時(shí)可啟動(dòng)Wnt3a信號(hào)通路抑制Dkk1和Axin2的表達(dá)，而發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控作用。此外，β-catenin也可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白Prop1和Pitx2，而共激活非TCF/LEF靶基因轉(zhuǎn)錄[12- 13]。在沒(méi)有Wnt配體的情況下，由Axin、GSK3β、APC和其他蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物可以促進(jìn)細(xì)胞衰老中Wnt通路的關(guān)鍵信號(hào)分子β-catenin磷酸化，并將β-catenin泛素化后降解。

非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白主要包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8和Wnt11，分別通過(guò)Wnt/Ca2+、Wnt/PCP、Wnt/RAP1、Wnt/ROR2、Wnt/PKA、Wnt/GSK3、Wnt/aPKC等途徑啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，或作用于Actin，影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞極性，或經(jīng)Wnt-GSK3-MT、Wnt-aPKC、Wnt-RYK、Wnt-mTOR影響微管蛋白生成、細(xì)胞趨化等。其中Wnt/Ca2+和Wnt/PCP途徑激活時(shí)，均由Wnt經(jīng)Fz受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜上的G蛋白及與之偶聯(lián)的Dvl后，Wnt/Ca2+途徑經(jīng)PLC/DAG/PKC，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，激活PKC/Cdc42作用于actin，影響細(xì)胞骨架，改變細(xì)胞極性、黏附和遷移等發(fā)揮作用，也可經(jīng)CaMKII/TAK1/NLK，阻斷β-catenin與TCF/LEF的結(jié)合；或使CAN磷酸化后，啟動(dòng)靶基因NF-AT等轉(zhuǎn)錄；也可經(jīng)PDE6/PKG，阻滯細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高；Wnt5a與Fz結(jié)合后，經(jīng)MKK3/6導(dǎo)致的p38活化，除啟動(dòng)ATF2等下游基因轉(zhuǎn)錄外，也為PDE6產(chǎn)生活性作用所必須。而Wnt5a或Wnt11/PCP途徑則經(jīng)Dvl-RhoA-Daam1復(fù)合物，激活Rock激酶和使MRLC磷酸化，Dvl-Rac1復(fù)合物則激活JUK激酶，使CapZIP/Dub磷酸化，最終通過(guò)Dvl的多種途徑，影響激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，參與細(xì)胞極性調(diào)節(jié)，或啟動(dòng)c-JUN等基因轉(zhuǎn)錄[14]。由非經(jīng)典Wnt5a信號(hào)途徑激活導(dǎo)致老化HSCs的極性喪失、再生能力降低和分化偏移，已被認(rèn)為是HSCs衰老的另一個(gè)重要分子機(jī)制[15]。

3 Wnt3a與Wnt5a轉(zhuǎn)換對(duì)HSCs衰老的調(diào)控

經(jīng)典Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路激活在促進(jìn)HSCs增殖、保持HSCs免疫表型、正常血細(xì)胞譜系分化和自我更新能力及改善機(jī)體造血功能重建中發(fā)揮著重要作用。衰老的HSCs不但向T 系淋巴細(xì)胞分化的能力顯著降低，Wnt/β-catenin表達(dá)量也明顯低于年輕的HSCs[13,16- 17]，且年輕的HSCs中經(jīng)典Wnt3a信號(hào)通路激活后，微管蛋白均勻地分布至胞膜，β-catenin主要分布于細(xì)胞核，而衰老的HSCs極性發(fā)生改變，微管蛋白在細(xì)胞膜分布十分不均，β-catenin則由細(xì)胞核轉(zhuǎn)向胞質(zhì)，低水平的β-catenin活化啟動(dòng)HSCs的自我更新，較高水平的β-catenin活化則驅(qū)動(dòng)HSCs的分化。氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白和氯化鋰經(jīng)DNA損傷所誘發(fā)的HSCs衰老與Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活密切相關(guān)。進(jìn)一步研究證明當(dāng)歸多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)和人參皂苷Rg1(ginsenoside，Rg1)拮抗ox-LDL等所引起的HSCs衰老，APS通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)、抑制端粒 DNA損傷及提高端粒酶活性的途徑延緩HSCs衰老，ASP拮抗D-半乳糖所致的小鼠Sca-1+造血干祖細(xì)胞衰老的作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活，下調(diào)p53/p21和p16INK4/Rb通路有關(guān)[18]。Rg1具則通過(guò)調(diào)控 Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游的p53/p21信號(hào)分子，而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，并減輕DNA損傷及延緩Sca- 1+造血干祖細(xì)胞衰老[19]。盡管已發(fā)現(xiàn)高水平的miR- 146a- 5p可直接作用于靶基因Wnt5a和Wnt1，使2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，經(jīng)抑制β-catenin、NFAT5和激活GSK- 3β，而抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮抗肝纖維化作用，但是對(duì)HSCs中直接影響Wnt信號(hào)的上游分子的了解還十分有限[20]。

經(jīng)典向非經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)換對(duì)導(dǎo)致年齡相關(guān)或無(wú)關(guān)的HSCs衰老及機(jī)體造血免疫功能失調(diào)中有重要意義。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中年(10 m)與老年(20～24 m)小鼠長(zhǎng)期造血的HSCs (Lin-Sca- 1+，c-Kit+，CD34+， Flk2-) 和Lin-細(xì)胞高表達(dá)Wnt5a和Wnt4，而年輕小鼠的這些細(xì)胞則基本不表達(dá)Wnt5a，衰老的HSCs中經(jīng)典Wnt通路中Wnt3a、Wnt1、Wnt5b和Wnt10b蛋白卻無(wú)明顯變化[21]。采用Wnt5a處理年輕小鼠的HSCs，表現(xiàn)出極性HSCs比例減少，自我更新增加，粒系細(xì)胞分化能力降低，而髓系細(xì)胞分化增強(qiáng)等HSCs 衰老特征，為Wnt5a通路激活后直接抑制HSCs中經(jīng)典Wnt3a信號(hào)傳導(dǎo)及降低β-catenin和Axin2水平所致[22]，蛋白酶體抑制劑MG- 132可明顯消除Wnt5a所致的β-catenin水平的降低，恢復(fù)HSCs的極性與功能特征。Wnt5a驅(qū)動(dòng)的非經(jīng)典信號(hào)途徑激活還可經(jīng)小Rho GTP酶-Cdc42而改變細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)，引起HSCs極性消失，導(dǎo)致HSCs 衰老，但選擇性Cdc42 活化的抑制劑casin可阻斷Wnt5a的這一效應(yīng)，使衰老的HSCs變年輕[4,23]。與過(guò)表達(dá)Wnt3a的 HSCs移植到放射性損傷小鼠的結(jié)果相反，過(guò)表達(dá)Wnt5a的HSCs移植后，小鼠骨髓和脾臟中髓系細(xì)胞生成增高，而淋系細(xì)胞明顯減少[24]。與Wnt5a+/+衰老小鼠不同，衰老的Wnt5a+/-小鼠與年輕Wnt5a+/+和Wnt5a+/-小鼠一樣擁有相當(dāng)數(shù)量的有極性HSCs，白細(xì)胞總數(shù)、B細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)量都較高，而粒細(xì)胞較少。shRNA沉默Wnt5a的老年小鼠HSCs移植實(shí)驗(yàn)也證明了與Wnt5a+/-小鼠相似的極性HSCs頻率和血象變化[22]。

此外，組蛋白去乙酰酶SIRT家族中的SIRT1可經(jīng)FOXO3介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激，正性調(diào)節(jié)HSCs的干性，保持Oct4、Nanog和Fgf5等干性基因表達(dá)，保持自我更新及其分化能力，維持HSCs池的穩(wěn)定。而SIRT6可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子LEF1及去乙酰基組蛋白3相互作用，抑制Wnt信號(hào)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，維持HSCs干性，產(chǎn)生與SIRT1相似的HSCs穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用。SIRT6缺失則通過(guò)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活，促進(jìn)HSCs增殖，及在HSCs連續(xù)性移植中表現(xiàn)出自我更新能力的顯著降低[25- 26]，SIRT2可負(fù)性調(diào)節(jié)GSK- 3β的表達(dá)，Wnt5a則能夠以不依賴GSK- 3β的方式，通過(guò)Siah2和APC降解β-catenin，從而降低經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的作用。

然而不可忽視的是，在Lin-HSCs與支持造血的基質(zhì)細(xì)胞的非接觸性共培養(yǎng)中，在骨髓基質(zhì)細(xì)胞、尿生殖嵴或胚胎干細(xì)胞加入Wnt5a，可明顯促進(jìn)HSCs自我更新和增殖能力的維持，而加入Wnt5a抗體則出現(xiàn)HSCs功能的抑制，也就是Wnt5a信號(hào)分子激活所致基質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白分子，在HSCs功能維持中起著重要作用。且Wnt5a+/-小鼠骨髓造血微環(huán)境中存在造血壁龕(niche)的缺陷，在此壁龕中更新的HSCs移植后，F(xiàn)-actin功能受抑，不能形成有極性的HSCs，從而嚴(yán)重影響HSCs的黏附、遷移和歸巢[27]，極大地影響移植成功率。

4 展望

盡管HSCs衰老的機(jī)制尚未完全闡明，但在不斷探討HSCs等成體干細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制的同時(shí)，人們也正在積極研究抗衰老的干預(yù)措施。在造血生態(tài)壁龕中，通過(guò)適當(dāng)降低HSCs內(nèi)衰老相關(guān)分子Wnt5a 蛋白表達(dá)水平或改變通路中Cdc42等其他分子的活性，或提高經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑功能，都可能使衰老的 HSCs 恢復(fù)青春，保持活力，該策略可能為解決 HSCs 衰老及其衰老相關(guān)疾病的發(fā)生提供新思路。

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