不同種屬來源肝素鑒定方法的研究進(jìn)展

嚴(yán)林俊，孫正國，陸毅祥，徐海燕(.南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 南通 6007；.南通麥杰生物科技有限公司，江蘇 南通 6007；. 如東縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 如東 6400)

肝素是一種抗凝劑，是預(yù)防治療血拴形成的重要藥物。臨床醫(yī)療中常常用到普通肝素和低分子肝素，普通肝素可以直接用作醫(yī)療藥物，也可以作為生產(chǎn)低分子肝素的原材料。普通肝素和低分子肝素的分子結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，都屬于一種糖胺聚糖的高度解聚混合物，平均分子量分別為15 000和5 000道爾頓[1]。在很多動物(例如牛、羊、豬、雞、狗、鯨魚等)的多種組織器官中(例如腸、肺、肝、皮膚等)都有肝素的存在，豬腸是目前臨床使用肝素的最重要的來源。反芻動物(牛、羊)也曾是藥用肝素的主要來源動物，但由于傳染性海綿狀腦病的存在，來源于反芻動物或者含有反芻動物成分的肝素現(xiàn)在已經(jīng)被視為不合格產(chǎn)品。豬源肝素易受反芻動物成分的污染，這些成分殘留在豬體內(nèi)，最終導(dǎo)致肝素含有反芻動物成分[2]。因此，肝素種屬來源的鑒定是肝素質(zhì)量檢測的一項重要指標(biāo)，尤其是其中反芻動物成分的檢測。目前，粗品肝素不同種屬來源的鑒定方法主要有兩種，一種是基于肝素本身的結(jié)構(gòu)的鑒定，一種是對肝素中殘留動物源成分的檢測。

1 基于肝素本身結(jié)構(gòu)的鑒定

不同來源的肝素鈉具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，也會引起不同的不良反應(yīng)。馬志華等[3]用肝素酶酶解不同種屬來源的粗品肝素鈉，以其酶解后的二糖組份為研究對象，通過陰離子交換高效液相色譜法(SAX-HPLC)法比較二糖的相對組成，鑒定種屬來源。同時在豬來源肝素中分別添加不同比例的牛來源肝素或羊來源肝素，經(jīng)肝素酶酶解后，通過SAX-HPLC法鑒別在豬來源肝素中是否能快速檢出不同種屬來源的其他肝素。結(jié)果顯示，對于不同種屬來源的粗品肝素鈉，它們的二糖組成具有顯著差異；若豬來源肝素混入5%羊來源肝素，即可通過其二糖組成判斷。但文中結(jié)果也指出該方法并不能鑒別牛來源肝素的混入。毛細(xì)管電泳[4]、醋酸纖維素膜電泳[5]、高效液相色譜法[6]、核磁共振法等[7]方法也被應(yīng)用于肝素的檢測，但多被用于檢測多硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等雜質(zhì)的檢測，還未見用來鑒別肝素動物種屬來源的報道。

2 基于肝素中殘留動物成分的檢測

2.1 基于物種特異性蛋白的檢測方法

免疫學(xué)檢測方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實驗方法?？乖c相應(yīng)抗體相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，并在外界條件的影響下呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗體)檢測未知抗體(或抗原)。試驗所采用的抗體常存在于血清中，因此又稱之為血清學(xué)反應(yīng)。Rivera等[8]為了建立一種免疫學(xué)檢測技術(shù)來監(jiān)測提取粗品肝素的動物原材料來源，以牛腸粗品肝素的最終純化樣品為抗原，在兔子體內(nèi)構(gòu)建多克隆抗血清。他們在兩種不同的工業(yè)過程純化的牛粗品肝素中發(fā)現(xiàn)了一種重要的牛特異性抗原Ag1，在牛的肺、肝、小腸、脾、腎等器官中含量都很高，并發(fā)明了一種放射免疫分析法來定量Ag1抗原。利用這種免疫方法，6‰的牛源肝素溶于豬源肝素溶液(50 mg/mL)2 h后可以被檢測出來。Levieux等[9]為了能檢測生產(chǎn)肝素的豬小腸粘膜原料中的反芻動物(牛、羊)組織的含量，構(gòu)建了抗牛、羊、豬血清白蛋白的抗血清，并建立了相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測定法和單向免疫擴散法兩種免疫測定方法。其研究結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫法靈敏度很高，豬小腸粘膜中只含有1 ng/mL的牛血清蛋白或者10 ppm的牛小腸粘膜都能檢測出來。而對于一般檢測，單向免疫擴散法更為方便但靈敏度較低，能檢測出2 μg/mL血清白蛋白或者3‰的牛羊小腸粘膜；而且由于牛腸和牛肺所含的白蛋白更多，因此單向免疫擴散法對他們的檢測更為靈敏，分別達(dá)到1.5‰和0.9‰。Levieux等[10]發(fā)明了新的酶聯(lián)免疫吸附測定法，以粗品肝素中的特異抗原雜質(zhì)或者純化過程中色譜分離的洗脫物為抗原制造兔抗血清。利用這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫法能從粗品肝素中檢測出低至0.6‰到1.5‰的綿羊和山羊的成分。

2.2 基于物種特異性的DNA分析方法

由于蛋白質(zhì)在動物死亡后很容易失活，其存在和特點也依賴于細(xì)胞的類型，因此基于物種特異性蛋白的檢測方法有很大的局限性，依賴于特定物種的DNA分析方法相對而言在檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性都有著明顯的優(yōu)勢。陳川等[11]通過柱回收和膠回收兩步回收法，從粗品肝素鈉中提取動物殘留核酸，以其為模板，通過常規(guī) PCR 法進(jìn)行種屬來源的鑒定。分別以豬、羊來源的核酸為模板，用 3 種種屬特異性引物進(jìn)行 PCR 擴增，驗證引物的特異性；對柱回收、膠回收和兩步回收法提取的核酸樣品及含不同比例羊來源肝素鈉的混合樣品進(jìn)行 PCR 檢測，并檢測 3 批次肝素鈉樣品的種屬來源。結(jié)果顯示，豬的引物能特異性擴增豬來源的核酸，羊的引物能特異性擴增羊來源的核酸；采用單一膠回收和柱回收法提取的殘留核酸，不能有效地利用常規(guī) PCR 鑒定種屬來源，而兩步回收法提取的殘留核酸，能有效地利用常規(guī)PCR鑒定種屬來源；采用兩步回收法提取核酸，可檢測到含 1%羊來源肝素鈉的混合樣品；3 批次的肝素鈉樣品中均混有羊肝素鈉。Huang等[12]用七種方法從工業(yè)豬粗品肝素中提取殘留DNA，并用抑制物控制性PCR(inhibitor-controlled PCR)驗證DNA提取的效果，結(jié)果證明只有瓊脂糖凝膠純化方法可以完全消除工業(yè)豬粗品肝素中的PCR抑制物質(zhì)。于智勇等[13]對家豬、野豬及其他7種動物的線粒體DNA(mtDNA)D-loop區(qū)進(jìn)行序列分析, 設(shè)計了專門用于鑒別豬基源肝素鈉的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，對家豬、野豬及其他7種動物來源的肝素、肌肉或血液共49個樣品的基源進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果表明，AS-PCR及ARMS方法均可用于豬基源肝素粗品的快速鑒別。王自強等[14]利用土壤基因組DNA提取純化試劑盒從肝素鈉粗品及原料藥中提取殘留核酸，以其為模板，通過常規(guī)PCR及實時熒光PCR 法進(jìn)行動物源性成分鑒定。以提取豬肝、牛心、羊肝的DNA 為對照品，驗證所建立的檢測方法的特異性及靈敏度，并用以上兩種方法對3 批肝素鈉粗品及4 批肝素鈉原料藥進(jìn)行動物源性成分鑒定。結(jié)果表明，采用的兩種PCR方法對豬、牛、羊源性成分的鑒定具有特異性，且靈敏度分別達(dá)到pg級及10-1pg級。Concannon等[15]根據(jù)反芻動物Bov-A2短散布核元件序列和豬的PRE1短散布核元件序列設(shè)計引物和探針，用肝素酶處理豬粗品肝素樣本，并用熒光定量PCR方法來檢測其中的反芻動物DNA，能定量出范圍為0.3～3 000 ppm反芻動物DNA。Houiste等[16]用熒光定量PCR檢測低分子肝素的種屬來源，可以檢測出低至1 ppm的牛和10 ppm的綿羊污染物，而且認(rèn)為熒光定量PCR法結(jié)合二糖分析可以更好地控制低分子肝素的質(zhì)量。

我國的生豬屠宰量占全球50%以上，擁有全球最豐富的肝素原料資源，肝素原料藥產(chǎn)量在全球占絕對優(yōu)勢，是全球最為重要的肝素粗品和原料藥的主要生產(chǎn)國和出口國。近年來，歐美對肝素執(zhí)行越來越嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，肝素中反芻動物成分成為出口肝素檢測的重要指標(biāo)之一。建立操作方便簡單，成本低廉，重復(fù)性好，檢測靈敏度高的反芻動物成分檢測方法十分必要，既可以保證我國肝素生產(chǎn)出口的優(yōu)勢，還能間接促進(jìn)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。在目前的檢測方法當(dāng)中，包括常規(guī)PCR法、實時熒光定量PCR法在內(nèi)的基于物種特異性的DNA分析方法是目前的主流檢測方法，但這些方法中還有值得改進(jìn)和優(yōu)化的地方。一方面，殘留DNA的提取方法可以優(yōu)化。肝素對PCR技術(shù)有著強烈的抑制作用，50 μL PCR反應(yīng)體系中，低于0.002 U的肝素就可以強烈抑制PCR的進(jìn)行[17]，因此提取的殘留動物DNA必須沒有肝素雜質(zhì)?，F(xiàn)有的肝素酶消化法成本高昂，肝素酶穩(wěn)定性差；而瓊脂糖凝膠純化法、土壤基因組DNA提取純化試劑盒、膠回收柱回收兩步回收法等也沒有得到很好的認(rèn)證和應(yīng)用，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化殘留DNA的提取純化方法。另一方面，DNA分析方法可以優(yōu)化。實時熒光定量 PCR實現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的突破，而且具有特異性強、靈敏度高、速度快、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、全封閉等優(yōu)點，迅速成為了現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的重要工具。其使用的熒光化學(xué)方法主要有DNA結(jié)合熒光染料、水解探針、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物、雜交探針等五種，成本也各不相同，因此需要實驗并找尋合適的、靈敏的、低廉的熒光化學(xué)方法。

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