三維培養(yǎng)下應(yīng)力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響研究進(jìn)展

張旭林，徐永清，毛羽馳,何曉清，劉 帥

作者單位：650032昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)研究生部（張旭林，毛羽馳，劉 帥）；解放軍920醫(yī)院骨科（張旭林，徐永清，何曉清，劉 帥）

在骨科臨床實(shí)踐中，伊利扎諾夫技術(shù)（Ilizarov）解決了許多令醫(yī)生們頭疼的疑難雜癥，其治療適應(yīng)證也在基礎(chǔ)研究的帶領(lǐng)下不斷拓寬，如糖尿病足、腦中風(fēng)、脊柱側(cè)彎等。而該技術(shù)的核心“張力-應(yīng)力法則”，則進(jìn)一步將應(yīng)力與細(xì)胞分化聯(lián)系在一起。但該技術(shù)目前最大的阻礙是長時(shí)間佩戴給患者帶來的不便及引起的各種臨床并發(fā)癥[1]。隨著伊利扎諾夫技術(shù)的推廣，尋求縮短治療時(shí)間和減少并發(fā)癥的方法顯得極為重要。而三維細(xì)胞培養(yǎng)可能是解決上述問題的有效措施的基礎(chǔ)之一，因此，筆者對(duì)三維培養(yǎng)下應(yīng)力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 三維培養(yǎng)對(duì)應(yīng)力下間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化研究的優(yōu)勢(shì)

MSCs是一種具有多向分化潛能，來源于中胚層和神經(jīng)外胚層，并且不表達(dá)造血系相關(guān)標(biāo)志的成體多能干細(xì)胞[2]。根據(jù)來源可以分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞等。目前相關(guān)文獻(xiàn)均認(rèn)為身體的各部分間充質(zhì)內(nèi)均含有MSCs，而且其比成體干細(xì)胞有更大的分化潛能，同時(shí)也減少了倫理審查的要求，所以，MSCs從發(fā)現(xiàn)之初便被寄予厚望[3-4]。但在諸如實(shí)驗(yàn)室普通細(xì)胞瓶等二維培養(yǎng)環(huán)境下，MSCs分化率低。而立體培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)而言，更能模擬身體內(nèi)細(xì)胞的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞的基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)，更有利于模擬牽拉成骨過程中應(yīng)力對(duì)MSCs分化的影響，進(jìn)而研究提高牽拉成骨效率的方法。

1.1 三維培養(yǎng)下細(xì)胞聯(lián)系密切 二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是近代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，但是，以這種模式所建立的細(xì)胞模型與細(xì)胞實(shí)際所處的生長環(huán)境有差異，不能像體內(nèi)一樣進(jìn)行信號(hào)通路和內(nèi)分泌傳導(dǎo)。而三維培養(yǎng)作為一種更接近于機(jī)體生理環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)方式，它更能給細(xì)胞提供生長和信息傳遞所需的仿生環(huán)境?；诖颂攸c(diǎn)，在腫瘤、干細(xì)胞、組織工程等領(lǐng)域中，三維細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用價(jià)值更為突出。Hanahan等[5]研究表明，三維培養(yǎng)下更能觀察到腫瘤獨(dú)特的性質(zhì)，包括獨(dú)特的生長信號(hào)、永生性、無限復(fù)制、失控的血管增殖、組織侵襲、躲避免疫攻擊、促進(jìn)腫瘤的炎癥等特性。所以，不斷有研究者利用三維培養(yǎng)來論證其優(yōu)勢(shì)。Wang等[6]用三維培養(yǎng)來研究前列腺癌，證實(shí)了細(xì)胞與三維支架所形成的結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的分化和表型均有幫助；Kim等[7]通過乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，三維細(xì)胞培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)在同一體系中培養(yǎng)不同表型的腫瘤細(xì)胞，比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)更準(zhǔn)確地模擬腫瘤組織的結(jié)構(gòu)和分化。

三維細(xì)胞培養(yǎng)類型根據(jù)外力施加的有無分為靜止三維培養(yǎng)和動(dòng)力三維培養(yǎng)，其中由于靜止三維培養(yǎng)過程中重力是唯一的力學(xué)影響因素，而本綜述涉及的是外界應(yīng)力，所以，本研究只討論動(dòng)力三維培養(yǎng)。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞間不僅通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)增殖和分化，也通過應(yīng)力的變化產(chǎn)生聯(lián)系。臨床應(yīng)用中Ilizarov技術(shù)就是一個(gè)很好的例子，通過緩慢牽拉組織來使某些組織獲得再生。Leucht等[8]的研究表明，應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)傳遞到細(xì)胞，而應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的刺激可以改變細(xì)胞內(nèi)部應(yīng)力的分布，使細(xì)胞發(fā)生變形，通過細(xì)胞膜上信號(hào)受體與周圍細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系。中外學(xué)者針對(duì)應(yīng)力對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的影響做了很多研究，戚孟春等[9]對(duì)MSCs施加高應(yīng)力，然后觀察到細(xì)胞骨架F-actin（細(xì)胞框架的主要成分）解聚和重排的現(xiàn)象，不僅說明了高應(yīng)力對(duì)細(xì)胞骨架的破壞，而且說明細(xì)胞骨架是應(yīng)力的傳導(dǎo)途徑。此外，在細(xì)胞應(yīng)力與細(xì)胞內(nèi)聯(lián)系的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)整合素、第二信使系統(tǒng)、應(yīng)力反應(yīng)原件（一種受應(yīng)力影響的順式調(diào)控原件）都是應(yīng)力與細(xì)胞溝通的重要組成部分[10-12]。而在這個(gè)連接通路上，細(xì)胞外基質(zhì)、整合素和細(xì)胞骨架所構(gòu)成的系統(tǒng)把應(yīng)力從力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)起了極其重要的作用。而陳晨等[13]認(rèn)為，局部黏附蛋白也參與構(gòu)建了這個(gè)系統(tǒng)。而三維培養(yǎng)在生物支架的幫助下，可以使細(xì)胞間形成上述的“應(yīng)力傳遞系統(tǒng)”。

1.2 三維培養(yǎng)下細(xì)胞所受應(yīng)力 目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)使用的方法有：細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)、基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)等[14]，這幾種方法給細(xì)胞所提供的力學(xué)因素有利于促進(jìn)其增殖分化和形成外基質(zhì)。能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響的應(yīng)力目前主要包括微重力、剪切力、張力和壓力，在MSCs分化方面，流體靜壓也可以促進(jìn)其向軟骨分化。三維培養(yǎng)中能穩(wěn)定提供的是微重力（旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器可以模擬微重力失重狀態(tài)）和剪切力，而提供的流體剪切力不僅不會(huì)引起細(xì)胞破損，而且還有利于細(xì)胞成骨化[15]。但由于這些培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的應(yīng)力不能方便廉價(jià)的提供張力和壓力，使外界牽拉力很難應(yīng)用與細(xì)胞培養(yǎng)中。水凝膠基質(zhì)材料常規(guī)都是單純的彈性材料，不能施加應(yīng)力，但哈佛的Ovijit等改良了普通的三維水凝膠培養(yǎng)法，其制作的有快速應(yīng)力松弛性質(zhì)的水凝膠能夠產(chǎn)生的彈性模量為17 kPa，能夠誘導(dǎo)MSCs形成天然骨基質(zhì)。這種方法不僅簡化了額外應(yīng)力的供應(yīng)，而且還促進(jìn)MSCs增殖分化[16]，最重要的是水凝膠本來就是三維培養(yǎng)中的骨架材料。

2 應(yīng)力對(duì)MSCs分化的影響

生理狀態(tài)下，受機(jī)體運(yùn)動(dòng)及重力的影響，體內(nèi)細(xì)胞的行為與張力、壓力、剪切力、重力等應(yīng)力有著密切的關(guān)系，這些應(yīng)力可能會(huì)對(duì)機(jī)體的生長發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。

2.1 應(yīng)力大小與細(xì)胞分化 在體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，外界應(yīng)力刺激，會(huì)對(duì)細(xì)胞生長產(chǎn)生影響。劉天一等[17]通過用每天2次、每次0.5 h的離心力來處理骨髓MSCs，經(jīng)1～2個(gè)月后觀察發(fā)現(xiàn)，使用應(yīng)力的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了更多的蛋白聚糖，說明MSCs在足夠應(yīng)力的刺激下產(chǎn)生了分化。Chaudhuri等[16]通過控制藻酸鹽水凝膠的納米級(jí)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)水凝膠的的應(yīng)力松弛性能，從而模擬活組織的粘彈行為來進(jìn)行間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的彈性模量會(huì)影響干細(xì)胞分化的方向，當(dāng)彈性模量在10 kPa以內(nèi)時(shí)，其主要向脂肪細(xì)胞分化；而彈性模量升高到11～30 kPa時(shí)，其會(huì)向成骨細(xì)胞分化；同時(shí)在9 kPa和17 kPa時(shí)，向脂肪細(xì)胞分化的能力降低甚至不分化。Li等[18]通過先使用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基來對(duì)大鼠的MSCs進(jìn)行前期培養(yǎng)，再對(duì)其施加液態(tài)靜壓力和大小為13～36 kPa、頻率為0.25 Hz的動(dòng)態(tài)液體壓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原纖維α1和聚集蛋白聚糖的基因表達(dá)增加，同時(shí)硫酸化糖胺聚糖發(fā)生富集，說明在應(yīng)力的作用下，細(xì)胞產(chǎn)生了相應(yīng)的應(yīng)答，趨向于軟骨分化。

2.2 應(yīng)力類型與細(xì)胞分化 在應(yīng)力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）的來源中，滲透壓所產(chǎn)生的應(yīng)力是一個(gè)特殊的類型。在機(jī)體生理?xiàng)l件下，關(guān)節(jié)軟骨受到的滲透壓為350～450 mOsm。Caron等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提高軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基的滲透壓來增加MSCs Sox9、Col2α1、aggreca基因的表達(dá)。Lu等[20]通過對(duì)MSCs施加可調(diào)控的流體剪切力，發(fā)現(xiàn)不同的剪切力會(huì)影響MSCs向成骨或軟骨細(xì)胞的分化。Alves等[21]用三維培養(yǎng)模式動(dòng)態(tài)灌注的方法，模仿生理?xiàng)l件下關(guān)節(jié)所受的剪切力，作者將MSCs接種于纖維支架上，實(shí)驗(yàn)組放于灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含剪切力的實(shí)驗(yàn)組MSCs發(fā)生了分化。霍建忠等[22]應(yīng)用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)以20 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)兔MSCs，發(fā)現(xiàn)三維應(yīng)力組的軟骨特異性基質(zhì)和Ⅱ型膠原酶的mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。上述研究表明，應(yīng)力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）對(duì)MSCs的生長、增殖及分化會(huì)產(chǎn)生重要的影響，尤其是在三維培養(yǎng)下，細(xì)胞應(yīng)力的傳遞系統(tǒng)更完整，對(duì)MSCs分化的促進(jìn)作用更明顯，但應(yīng)力對(duì)MSCs分化方向的影響機(jī)制尚未研究清楚。

3 未來與展望

目前，以牽拉成骨為代表的Ilizarov技術(shù)以其神奇的功效，不斷拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。但治療周期長、釘?shù)栏腥?、外固定架調(diào)整、影響生活等問題難以解決。對(duì)于這些問題，不斷有學(xué)者探索解決的方法，倪明等[23]通過在牽拉成骨動(dòng)物模型中注入富血小板血漿及脫鈣骨基質(zhì)，探索采用外界干預(yù)來縮短牽拉成骨時(shí)間的方法。對(duì)這類問題的探究或許可以改變很多疑難雜癥的治療方案。而三維培養(yǎng)下研究應(yīng)力與MSCs分化的關(guān)系，可以為解決這類問題提供基礎(chǔ)。