豬流行性腹瀉病毒診斷技術(shù)概述

(山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心 范村鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山西 太谷 030800)

0 引言

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，冠狀病毒科的冠狀病毒屬成員，1978年在歐洲被發(fā)現(xiàn)[1]。自從在歐洲初步分離以來，PEDV已經(jīng)擴(kuò)散到世界上幾個(gè)主要的養(yǎng)豬產(chǎn)地，包括亞洲和北美洲。1982年該病毒首次在日本被發(fā)現(xiàn)，并逐漸蔓延到幾個(gè)鄰近國家，包括韓國、中國、泰國、中國臺(tái)灣和越南。2013年，PEDV蔓延到北美，在美國最初被發(fā)現(xiàn)，隨后擴(kuò)散到加拿大和墨西哥[2]。在美國，PEDV侵入后迅速傳播至全國，導(dǎo)致700多萬頭仔豬死亡(占該國豬群總數(shù)的10%)。PEDV是豬流行性腹瀉(PED)的致病因子，能夠引起急性，高度傳染性的嚴(yán)重腸道疾病。所有年齡的動(dòng)物都對(duì)PEDV易感[3]。然而，成年豬通常呈現(xiàn)較輕的癥狀，死亡率較低，低日齡的仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐，脫水而死，病死率極高。PEDV的嚴(yán)重致病性已對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了不容小覷的經(jīng)濟(jì)損失，快速、準(zhǔn)確的診斷病原尤為重要。

1 病毒分離

Vero細(xì)胞是使用最廣泛的細(xì)胞系，可用于PEDV的分離和增殖[4]。PEDV的自我復(fù)制能誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，包括細(xì)胞融合，合胞體形成和細(xì)胞脫離。細(xì)胞培養(yǎng)過程中PEDV的復(fù)制取決于細(xì)胞培養(yǎng)基中外源性胰蛋白酶[5]。胰蛋白酶的蛋白水解活性導(dǎo)致S糖蛋白分解成為S1和S2亞基，增強(qiáng)病毒的感染性，促進(jìn)其與細(xì)胞融合并在細(xì)胞中釋放。因此，必須在培養(yǎng)基中加入外源性胰蛋白酶，用于增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)物PEDV的分離。

2 病毒中和試驗(yàn)(VN)

VN是利用PEDV的特異性抗體結(jié)合病毒，阻斷病毒的復(fù)制周期，誘導(dǎo)病毒顆粒的凝集或裂解，降低PEDV的感染力。目前，基于CPE的VN已經(jīng)用于PEDV的抗體中和反應(yīng)的檢測(cè)。

3 免疫熒光(IF)

免疫熒光(IF)測(cè)定已被用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的PEDV抗原以確認(rèn)是否分離成功，或用于腸組織冷凍切片中檢測(cè)感染腸細(xì)胞中的病毒抗原。IF是使用熒光基團(tuán)偶聯(lián)的PEDV特異性抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在感染的各個(gè)階段，包括涉及疾病潛伏期的早期階段，在整個(gè)小腸的絨毛上皮細(xì)胞中通過IF都能檢測(cè)到PEDV抗原。在臨床癥狀出現(xiàn)后，通過IF法在腸樣品中能檢測(cè)到病毒抗原的時(shí)間長達(dá)72 h。

4 免疫組化(IHC)

IHC是在免疫學(xué)(抗原-抗體)和化學(xué)標(biāo)記的基礎(chǔ)上標(biāo)記PEDV特異性抗體，通過化學(xué)底物顯色對(duì)PEDV抗原進(jìn)行定位檢測(cè)。IHC可對(duì)各種組織和細(xì)胞切片進(jìn)行檢測(cè)，可對(duì)PEDV的感染過程進(jìn)行定位。石蠟切片是制備組織切片最常用的方法，可長期保存，有利于組織樣品的回顧性檢測(cè)[6]。

5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法可用于各種病料、樣品的檢測(cè)，相比其他的抗原檢測(cè)法，本方法的靈敏度更高，特異性更強(qiáng)[7]。傳統(tǒng)的RT-PCR主要是通過設(shè)計(jì)病毒的特異性引物對(duì)PEDV基因組的靶區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在傳統(tǒng)RT-PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，能夠進(jìn)行定量且定性的分析，靈敏度更高[8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其模板不再需要預(yù)變性，可以在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，無需特殊儀器，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍更廣[9]。針對(duì)PEDV的檢測(cè)，目前已設(shè)計(jì)了兩種LAMP檢測(cè)法，分別是對(duì)PEDV的M基因和N基因設(shè)計(jì)4～6對(duì)特異性引物，并與傳統(tǒng)檢測(cè)方法如ELISA和RT-PCR進(jìn)行了比較性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，RT-LAMP的成本更低、敏感度更高、特異性更好，具有更廣闊的應(yīng)用前景[10]。

6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

目前，間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)阻斷ELISA已用于PEDV的檢測(cè)。其中，間接ELISA是基于全病毒在細(xì)菌中表達(dá)的重組病毒蛋白質(zhì)(S，N和M)。在該方法中，首先將病毒抗原固定在聚苯乙烯表面上，并與待檢樣品孵育以形成抗體-抗原復(fù)合物[11]。通過使用與比色底物偶聯(lián)的酶聯(lián)二抗來進(jìn)行檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)阻斷ELISA是基于PEDV的特異性單克隆抗體或多克隆抗體，將抗原與待檢樣品一起包被于微孔板，與血清中存在的抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原[12]。

ELISA方法雖然操作簡(jiǎn)單，但也存在一定的局限性，只能檢測(cè)其是否發(fā)生感染過PED，無法確定是否正在發(fā)病。

7 熒光微球免疫測(cè)定(FMIA)

熒光微球免疫測(cè)定(FMIA)是基于流體熒光微球激光掃描系統(tǒng)，其具有優(yōu)于ELISA的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括靈敏度高，更高通量，以及同時(shí)檢測(cè)多種病原體的能力。 FMIA基于將特異性病毒抗原偶聯(lián)到熒光微球，使用雙激光儀器檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)，并且結(jié)果表示為中值熒光強(qiáng)度(MFI)。

8 膠體金免疫技術(shù)(GICT)

GICT是利用膠體金作為指示標(biāo)記進(jìn)行免疫標(biāo)記，是一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑的作用下形成穩(wěn)定狀態(tài)的金顆粒[13]。此方法與ELISA相似，具備價(jià)格低、操作簡(jiǎn)單、特異性好、快捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于大量臨床樣品檢測(cè)，有很好的應(yīng)用前景。

PEDV快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)是對(duì)PED進(jìn)行治療和預(yù)防的首要且最為關(guān)鍵的工作，是重中之重。本文的主旨就是對(duì)PEDV的主要檢測(cè)方法進(jìn)行概述和分析，各種方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，尤其是在臨床檢測(cè)的過程中，結(jié)合實(shí)際的發(fā)病情況，實(shí)驗(yàn)室的條件設(shè)施，檢測(cè)人員的技術(shù)水平等多方面的因素，去選擇最為合適的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。如果條件允許的話，最好采用兩種以上的方法進(jìn)行相互印證，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為臨床防控提供更為準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)，更好地監(jiān)測(cè)PEDV的發(fā)生和流行，有效控制和降低PED的暴發(fā)和帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

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