小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄因子PsSte12的克隆及生物學(xué)分析

黃雪玲，付 潔

(1西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2 盤錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124000)

小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)主要的糧食作物，在我國的播種面積以及產(chǎn)量僅次于水稻，為我國糧食生產(chǎn)的重要組成部分。由小麥條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici,Pst)引起的小麥條銹病一直是威脅我國主要產(chǎn)麥區(qū)的最重要病害之一。利用抗病品種和藥劑防治是防控小麥條銹病的基本策略，而研究小麥條銹菌的致病機(jī)制將為制定小麥條銹病的防控策略提供理論依據(jù)。

早期對(duì)于小麥條銹菌致病機(jī)制的研究主要集中在病原菌侵染過程中超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞化學(xué)、異核作用及非生物因子對(duì)條銹菌致病性的影響[1-4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和完善，包括小麥稈銹菌(Pucciniaf.sp.graminis)、小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)和Pst在內(nèi)的一大批真菌都完成了基因組測(cè)序[5-6]，使得在基因組范圍內(nèi)對(duì)基因進(jìn)行系統(tǒng)分析成為可能,其中研究較多的是真菌發(fā)育過程相關(guān)基因[7-10]、真菌侵染過程誘導(dǎo)表達(dá)的基因[11-12]及與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因[13]。信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于了解細(xì)胞中各種生物學(xué)過程具有重要意義。根據(jù)Park等[14]對(duì)真菌轉(zhuǎn)錄因子的分類標(biāo)準(zhǔn)，小麥條銹菌的轉(zhuǎn)錄因子主要分為Zn2Cys6 鋅簇、CCHC鋅指、C2H2鋅指、GATA因子、b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子、APSES轉(zhuǎn)錄因子、Forkhead轉(zhuǎn)錄因子、熱激因子、MADS-BOX因子、NFX1 轉(zhuǎn)錄因子、STE轉(zhuǎn)錄因子及TEA轉(zhuǎn)錄因子等類型。目前，在真菌中對(duì)于Zn2Cys6 鋅簇、GATA因子、b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子、MADS-BOX因子及STE轉(zhuǎn)錄因子均有較多的研究[15-19]。

STE轉(zhuǎn)錄因子是真菌中獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄因子，通常被稱為Ste12轉(zhuǎn)錄因子。由于與MAPK途徑存在密切關(guān)系，Ste12引起人們的廣泛關(guān)注[19]。對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Ste12轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，Ste12通過與其他基因形成兩套不同的復(fù)合體，從而控制釀酒酵母的交配及菌絲形成[20]。在許多植物病原菌中也發(fā)現(xiàn)了STE轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的研究發(fā)現(xiàn)，Ste12突變體形成的附著胞不能產(chǎn)生入侵栓[21]，說明Ste12直接參與了病原菌的入侵過程。對(duì)瓜類炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)的研究表明，Ste12不影響附著胞的發(fā)育，但是突變體缺乏果膠酶活性以及細(xì)胞表面黏附因子，導(dǎo)致不能對(duì)寄主進(jìn)一步入侵[22]。Gu等[23]研究結(jié)果表明，Ste12轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的致病力也起到至關(guān)重要的作用，Ste12突變體在植物寄主中入侵和擴(kuò)展能力明顯喪失。以上研究結(jié)果表明，Ste12轉(zhuǎn)錄因子是決定病菌致病力的重要因素。因此，對(duì)該類基因的研究對(duì)于探索病菌致病機(jī)理具有重要意義。

通過對(duì)小麥條銹菌全基因組進(jìn)行分析，筆者發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌也存在STE類型轉(zhuǎn)錄因子。基于該類型轉(zhuǎn)錄因子在眾多病菌中的重要作用，本研究擬鑒定克隆STE類型轉(zhuǎn)錄因子，分析其表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而探索STE類型轉(zhuǎn)錄因子在小麥條銹菌與小麥互作中的功能，以豐富對(duì)小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄因子的認(rèn)識(shí)，為揭示小麥-小麥條銹菌互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為制定小麥條銹病的防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試小麥(Triticumaestivum)品種水源11和小麥條銹菌CYR32生理小種，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供。水源11與條銹菌CYR32組成親和組合。

1.2 方 法

1.2.1 接種及取樣 小麥植株的培育和小麥條銹菌的接種均按康振生等[24]的方法進(jìn)行。分別于接種后12，24，36，48，120和216 h剪取接種葉片，液氮速凍后于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 采用RNA提取試劑盒(Invitrogen，USA)提取樣品總RNA，然后用DNA酶Ⅰ對(duì)DNA進(jìn)行去除。對(duì)于小麥條銹菌侵染的小麥葉片，采用液氮研磨的方法破碎細(xì)胞。對(duì)于小麥條銹菌夏孢子，采用液氮結(jié)合干冰的方法研磨樣品，具體方法為：用液氮預(yù)冷研缽及研杵，在研缽中加入無菌的石英砂及干冰；用研杵將干冰搗碎后倒入100 mg小麥條銹菌夏孢子，迅速研磨至干冰即將完全升華時(shí)加入裂解液；待氣體完全排除后，按試劑盒說明書中操作步驟進(jìn)行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，并利用核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDropTM2000測(cè)定RNA的濃度及純度。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)對(duì)總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。試驗(yàn)全程使用不含RNA酶的耗材，合成的cDNA模板10倍稀釋后用于基因克隆和實(shí)時(shí)定量PCR分析。

1.2.3 小麥條銹菌PsSte12基因的克隆 本課題組之前已經(jīng)獲得小麥條銹菌CYR32全基因組序列，并且對(duì)所有預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行了功能注釋[6]。從已有基因組序列中提取Ste12同源基因片段，將該序列與Broad institute數(shù)據(jù)庫(https://data.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group/MultiHome.html)小麥條銹菌Pst78序列進(jìn)行比較，最終確定候選PsSte12基因ORF序列。為證實(shí)該序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因ORF的引物，上游引物序列為5′-ATGGCCGCTGAAGTTTCG-3′，下游引物序列為5′-TCATGAGGAATGGTCAGAG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)模板為小麥條銹菌夏孢子cDNA與接種條銹菌后不同時(shí)間點(diǎn)小麥樣品cDNA混合物。DNA聚合酶采用Prime STAR?HS DNA Polymerase(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收(Bioteke)后克隆至pGEM-Teasy(TaKaRa)載體，將載體送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司，采用通用引物T7和SP6進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析 使用Prot-Param (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)PsSte12編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、正負(fù)電荷殘基數(shù)及原子組成；利用Inter-ProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/Inter-ProScan/)分析編碼氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。利用9氨基酸轉(zhuǎn)錄激活域預(yù)測(cè)工具(http://www.med.muni.cz/9aaTAD/)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄激活域。利用DNAMAN軟件分析目的基因氨基酸序列與其他物種序列的同源性，其他物種序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫。同時(shí)，利用DNAMAN將目的基因的核苷酸序列與小麥條銹菌CYR32基因組序列進(jìn)行比對(duì)，以期尋找到該基因ORF區(qū)域的內(nèi)含子。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR分析 利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)候選PsSte12基因ORF序列設(shè)計(jì)特異引物(F：5′-TAGCGGACTCAGCAGTATAG-3′；R：5′-CCGCCTCTGTTTGTATGTAG-3′)。以小麥條銹菌Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因[25]，利用CFX96TMReal Time System (Bio-Rad)進(jìn)行小麥條銹菌侵染過程中PsSte12表達(dá)譜分析。PCR反應(yīng)體系20 μL，包含10 μL SsoFastTMEvaGreen Supermix (Bio-Rad)，上下游引物(10 mmol/L)各0.8 μL，3 μL 10倍稀釋的cDNA模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 40次循環(huán)；讀板。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，溫度為65～95 ℃。所有試驗(yàn)樣品均重復(fù)3次。同時(shí)，每對(duì)引物的擴(kuò)增設(shè)未加模板對(duì)照，以檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增的背景。所有引物進(jìn)行擴(kuò)增效率檢測(cè)，擴(kuò)增效率在90%～105%的引物符合要求。利用2-ΔΔCt法對(duì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在試驗(yàn)中以小麥條銹菌夏孢子接種0 h樣品作為對(duì)照，用以確定目標(biāo)基因在侵染過程不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄活性分析 利用酵母單雜交系統(tǒng)對(duì)PsSte12蛋白的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析。將限制性酶切位點(diǎn)NcoⅠ(CCATGG)和BamHⅠ(GGATCC)分別引入擴(kuò)增PsSte12 N-端片段PsSte12-304，PsSte12完整ORF片段PsSte12-850的上下游引物中(如序列中下劃線所示)。上下游引物序列分別為(pSte304-fp：5′-CATGCCATGGAGATGGCCCA-CGCACAACAATTC-3′，pSte304-rp：5′-ATACGC-GGATCCCGGAAGAAGGGACGAGTAAGA-3′；pSte850-fp：5′-CATGCCATGGAGATGGCCCAC-GCACAACAATTC-3′，pSte850-rp：5′-ATGCGC-GGATCCCTTACATCCCATCAAAGACCG-3′)。以1.2.3節(jié)中構(gòu)建好的載體為模板，利用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序同1.2.3節(jié)，PCR反應(yīng)體系100 μL。利用試劑盒(Bioteke)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BamHⅠ(Thermo scientific)對(duì)純化產(chǎn)物和載體pGBKT7(Clontech)進(jìn)行雙酶切。PCR產(chǎn)物酶切體系60 μL，pGBKT7載體酶切體系80 μL，使用2×tango buffer、2×BamHⅠ和1×NcoⅠ，37 ℃酶切3 h。膠回收酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶試劑盒(Thermo scientific)對(duì)目標(biāo)片段和載體片段進(jìn)行連接。對(duì)于PsSte12-850，做2個(gè)10 μL連接反應(yīng)。反應(yīng)1：目標(biāo)片段與載體物質(zhì)的量比為2∶1，連接程序?yàn)?6 ℃ 10 min，20 ℃ 5 min，40 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)后4 ℃保存。反應(yīng)2：目標(biāo)片段與載體物質(zhì)的量比為5∶1，連接溫度22 ℃，連接反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，合并兩管反應(yīng)液。PsSte12-304與載體的連接方法同上述反應(yīng)2。將上述兩個(gè)片段與載體連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆酶切檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證。將通過測(cè)序驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入含有His3和LacZ報(bào)告基因的酵母菌株AH109(Clontech)。再將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到不含組氨酸及色氨酸的SD培養(yǎng)基上，用以篩選目標(biāo)片段的轉(zhuǎn)錄激活功能。采用X-α-gal為底物，利用濾膜試驗(yàn)檢驗(yàn)β-半乳糖苷酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsSte12基因的克隆與序列分析

根據(jù)已有小麥條銹菌CYR32基因組序列以及基因注釋，結(jié)合Broad institute數(shù)據(jù)庫中小麥條銹菌Pst78序列，找到1個(gè)Ste12基因同源片段pst32 17249，并最終確定候選PsSte12基因ORF序列。為證實(shí)該序列，在此基因ORF兩端設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、克隆后測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站的ORF finder程序?qū)Υ诵蛄羞M(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有1個(gè)長度2 553 bp的開放閱讀框(ORF)。該基因編碼850個(gè)氨基酸，含有75個(gè)正電荷殘基(Arg+Lys)和90個(gè)負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)。PsSte12蛋白含有12 829個(gè)原子，預(yù)測(cè)分子式為C4090H6247N1183O1283S26，分子質(zhì)量為93 352.3 ku，等電點(diǎn)6.26。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為55.33，所以此蛋白為不穩(wěn)定蛋白。目前該基因已提交GenBank，登錄號(hào)為KX761830。

對(duì)PsSte12保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列第71-178位為典型的STE結(jié)構(gòu)域，第485-540位為zf-C2H2結(jié)構(gòu)域。DANMAN分析PsSte12與其他物種Ste12氨基酸序列的同源性表明，該蛋白與小麥稈銹菌(XP_003325390.2)及楊樹銹菌(XP_007418009.1)中同源序列的相似性為87.9%和61.53%，與小麥赤霉菌(XP_011327056.1)和構(gòu)巢曲霉菌(cua71570.1)中同源序列的相似性分別為24.3%和25.2%，說明STE轉(zhuǎn)錄因子在銹菌目內(nèi)比較保守。由圖1可見，在PsSte12 N端具有明顯的STE結(jié)構(gòu)域，其中綠色劃線部分為STE結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)；C端具有zf-C2H2結(jié)構(gòu)域，與STE結(jié)構(gòu)域相比，zf-C2H2結(jié)構(gòu)域在真菌間的保守性較差。

2.2 PsSte12基因組序列分析

將PsSte12基因ORF序列在NCBI CYR32基因組中進(jìn)行BLASTn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因存在于CYR32 contig_8271上。利用DNAMAN將目的基因的核苷酸序列與CYR32 contig_8271序列進(jìn)行比對(duì)，顯示該基因含有4個(gè)內(nèi)含子，分別位于ORF序列第281，429，1 512和1 584位，長度分別為73，79，66和68 bp。

2.3 小麥條銹菌侵染過程中PsSte12的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量PCR分析PsSte12在小麥條銹菌不同侵染階段的表達(dá)模式，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，在小麥條銹菌侵染的前期，PsSte12的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，侵染后24和36 h，相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照表達(dá)水平的61和123倍；在接種后48 h，PsSte12相對(duì)表達(dá)量開始下降，直至接種后120 h，其表達(dá)量恢復(fù)到對(duì)照水平。

2.4 PsSte12的轉(zhuǎn)錄活性

將含有PsSte12-304、PsSte12-850的重組載體及對(duì)照pGBKT7載體分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109，繼而在SD/-Trp-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果(圖3)顯示，含有PsSte12-304和PsSte12-850的兩個(gè)轉(zhuǎn)化菌株都可以在三缺培養(yǎng)基上生長，并且轉(zhuǎn)化菌株可以被X-α-gal染成藍(lán)色。僅轉(zhuǎn)化空載體的轉(zhuǎn)化菌株不能在三缺培養(yǎng)基上生長。以上結(jié)果說明，含有PsSte12-304和PsSte12-850的重組載體都可以激活酵母下游的His3和LacZ報(bào)告基因，同時(shí)PsSte12蛋白的N端第1-340位具有轉(zhuǎn)錄激活功能。利用轉(zhuǎn)錄激活域預(yù)測(cè)軟件對(duì)PsSte12的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白N端第144-152位的SDFLELLFK序列組成一個(gè)匹配度很高的轉(zhuǎn)錄激活域，該位點(diǎn)很有可能就是PsSte12的轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)。

3 討 論

第一個(gè)Ste12基因發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[26]，該基因在釀酒酵母中對(duì)細(xì)胞形態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起調(diào)控作用。此后，大量Ste12基因從多種腐生或寄生的真菌中被鑒定出來[21-23,27]。Ste12蛋白以N端存在類似homeodomain motif的STE結(jié)構(gòu)域?yàn)榈湫吞卣鳎嬖谟趆omeodomain第3個(gè)螺旋的KQKVFFWFSVA序列在所有真菌Ste12蛋白中高度保守[28]。本研究鑒定的PsSte12除含有第71-178位的STE結(jié)構(gòu)域外，在第485-540位含有一個(gè)zf-C2H2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在不同類型真菌中存在高度的分化。zf-C2H2結(jié)構(gòu)域是真正絲狀真菌Ste12基因的重要特征[28]，但是鮮有對(duì)其功能研究的報(bào)道。對(duì)菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)的研究表明，zf-C2H2結(jié)構(gòu)域的敲除不會(huì)影響該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力，本研究也證實(shí)PsSte12蛋白C端zf-C2H2結(jié)構(gòu)域缺失不影響PsSte12的轉(zhuǎn)錄活性。但是，zf-C2H2結(jié)構(gòu)域完整性被破壞之后會(huì)嚴(yán)重影響病原菌體果膠酶的產(chǎn)生及對(duì)聚苯乙烯的黏附，進(jìn)而影響病原菌的致病力[29]，說明zf-C2H2結(jié)構(gòu)域可能也參與了該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控。

利用轉(zhuǎn)錄激活域預(yù)測(cè)軟件對(duì)該蛋白氨基酸序列的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在第144-152位存在匹配度很高的具轉(zhuǎn)錄活性的氨基酸序列。本研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子的N端第1-340位具有轉(zhuǎn)錄活性，表明PsSte12的轉(zhuǎn)錄激活域很有可能就在預(yù)測(cè)的SDFLELLFK位點(diǎn)。進(jìn)一步可以通過將該預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)進(jìn)行突變或缺失，驗(yàn)證其是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

利用組織細(xì)胞學(xué)對(duì)小麥與條銹菌親和互作過程研究表明，夏孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，于接種后12 h，在葉片氣孔下腔內(nèi)出現(xiàn)氣孔下囊并產(chǎn)生初生侵染菌絲[30]；然后，初生侵染菌絲向氣孔腔周圍的葉肉細(xì)胞擴(kuò)展，形成吸器母細(xì)胞[31]；接種后24 h，吸器母細(xì)胞入侵葉肉細(xì)胞產(chǎn)生吸器原體，然后分化出吸器頸和吸器體[30]；截至接種后48 h，初生菌絲的數(shù)目基本保持不變；接種48 h后，次生菌絲開始產(chǎn)生并大量形成。所以，接種后24和36 h是條銹菌開始形成吸器原體并最終形成成熟吸器的時(shí)期。本研究結(jié)果表明，PsSte12在接種后24和36 h相對(duì)表達(dá)量迅速升高，與條銹菌初生吸器形成的時(shí)間相一致，說明該轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控與吸器發(fā)育相關(guān)的基因或者參與調(diào)節(jié)吸器對(duì)寄主細(xì)胞的擴(kuò)展。