雞病毒性關(guān)節(jié)炎最新研究進(jìn)展

張 寧 ，胡曉悅 ，韓 昱 ，盧軍霞 ，趙志強(qiáng) ，趙博偉

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所 071000；2.河北北方學(xué)院 075000；3.石家莊工程職業(yè)學(xué)院 050061；4.河北省畜牧站 050031）

雞病毒性關(guān)節(jié)炎 (Viral arthritis)是由禽呼腸孤病毒(Avian reovirus)引起的，臨床上以跗、趾關(guān)節(jié)腫大，腱鞘發(fā)炎，腓腸肌斷裂，跛行為主要特征。1954年Faheyt Crawley首次從有慢性呼吸道疾病的雞呼吸道內(nèi)分離到禽呼腸孤病毒。美國、英格蘭、澳大利亞、意大利、日本、荷蘭、匈牙利等國均有報(bào)道，1985年我國王錫堃［1］等首次報(bào)道了雞病毒性關(guān)節(jié)炎。目前我國河北、山東、黑龍江、上海、四川、云南、湖北等多個(gè)省市地區(qū)都有該病的報(bào)道。因該病不僅會(huì)導(dǎo)致跋行、生長停滯，還可引起免疫抑制，增加霉形體、雞貧血因子、巴氏桿菌、大腸埃希氏桿菌、球蟲等感染的機(jī)會(huì)，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，故應(yīng)引起我們的高度重視。

1 病原學(xué)

呼腸孤病毒是RNA病毒，呈二十面體對(duì)稱的雙層衣殼結(jié)構(gòu)，無囊膜。病毒粒子直徑約為75nm，在氯化銫的浮密度為1.36～1.37g/mL。 ARV 對(duì)熱有抵抗力，能耐受 60℃ 8～10h，56℃ 能夠存活 22～24h 、37℃ 15～16周、4℃可以存活 3年以上、-63℃可以保存10年以上。半純化病毒于60℃5h條件下，其毒價(jià)降低，但并不完全使病毒失活。氯化鎂能夠增強(qiáng)病毒對(duì)熱的穩(wěn)定性。ARV對(duì)乙醚不敏感，70%乙醇、0.5%有機(jī)碘和5%過氧化氫溶液可滅活病毒。

禽呼腸孤病毒各毒株之間存在大量的交叉反應(yīng)，因此有些群不能作為獨(dú)立的血清型，病毒通常以抗原亞型存在。Wood［2］等對(duì)發(fā)現(xiàn)了11個(gè)血清型，各血清型毒株之間存在有很大程度的交叉中和關(guān)系。

2017年鐘麗［3］研究表明：不同地區(qū)、不同時(shí)間分離的流行毒株致病性不同。ARV病毒體內(nèi)復(fù)制能力與其致病性存在正相關(guān)性；ARV體內(nèi)復(fù)制能力并不是決定其致病性的唯一因素。某些基因片段單基因位點(diǎn)的突變可能會(huì)導(dǎo)致其致病性的不同，但具體位點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。

初次分離ARV一般用卵黃囊接種，在接種后3～5d雞胚死亡。ARV還可以在綠猴腎細(xì)胞（Vero）、豬腎細(xì)胞（PK）和貓腎細(xì)胞（CRFK）、兔腎(PK)、乳地鼠腎細(xì)胞（BHK-21/13）、佐治亞牛腎（GBK）、來自被誘導(dǎo)的纖維肉瘤的日本鴿細(xì)胞系(QT35)和雞淋巴母細(xì)胞內(nèi)生長。

2 流行病學(xué)

雞和火雞是ARV的自然宿主。2017年我國尚麗元［4］報(bào)道了莫莫格保護(hù)區(qū)3例丹頂鶴發(fā)生病毒性關(guān)節(jié)炎的病例。ARV可通過與感染動(dòng)物接觸水平傳播，也可通過雞胚垂直傳播。潛伏期的長短取決于病毒的致病型、宿主年齡和感染途徑。直接接觸和氣管內(nèi)接種病毒，發(fā)病潛伏期分別為13d和9d。自然感染發(fā)病多見于4～7周齡雞，發(fā)病率可高達(dá)100%，但死亡率通常低于6%。

該病傳播迅速，一年四季均可發(fā)生，一般呈散發(fā)或地方性流行。有些感染雞群沒有典型的臨床癥狀，但可引起不同程度繼發(fā)感染，或使其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染癥狀和病變加重，導(dǎo)致淘汰率和死亡率增加。

3 臨床癥狀及病理變化

ARV急性感染的主要特征是被感染雞跛行、關(guān)節(jié)腫脹、腱鞘炎、傳染性滑膜炎、生長停滯。急性感染的雞滑膜內(nèi)發(fā)生充血或存在出血點(diǎn)，腱鞘和關(guān)節(jié)囊發(fā)生充血。慢性感染的雞關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在較少的滲出物，腱鞘慢性纖維化，趾向后彎曲，跗關(guān)節(jié)軟骨潰爛，伴發(fā)肉芽組織的生成。心肌纖維之間的異嗜細(xì)胞浸潤，肝臟、腎臟、脾臟腫大，有些可見壞死灶。

4 診斷檢測(cè)

通過感染雞跛行、跗趾關(guān)節(jié)腫大等癥狀及肝脾腫大、滑膜細(xì)胞的萎縮及增生、心臟組織內(nèi)異嗜細(xì)胞浸潤等病理變化可作出初步診斷。但由于有些雞感染ARV后不表現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化，而且該病與維生素E和硒缺乏癥、痛風(fēng)等病的臨床癥狀相似，所以確診需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞病毒性關(guān)節(jié)炎主要有以下幾種方法：

4.1 病原學(xué)檢測(cè)方法

病毒分離雖然耗時(shí)較長，但檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確?？捎貌‰u的組織懸液、全血、血漿或其他易感的組織培養(yǎng)物，接種6～7日齡 SPF雞胚卵黃囊，接種后 3～5d雞胚胎出現(xiàn)死亡 ，胚胎明顯出血或紫紅，肝呈綠色，脾臟腫大。若通過尿囊接種10日齡SPF雞胚，接種后，雞胚的死亡規(guī)律基本和卵黃囊接種結(jié)果基本一致。取接種致死的雞胚絨毛尿囊膜或病變細(xì)胞做切片，電鏡下可觀察到胞漿內(nèi)包涵體和病毒呈晶格狀排列。

4.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

從可疑分離物接種或自然感染雞血清中檢測(cè)到抗體或ARV抗原，采用ELISA、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)等可從感染雞血清中檢測(cè)到特異性抗體。

2007年陳元坤［5］以差速離心純化的雞關(guān)節(jié)炎病毒(ARV)作為包被抗原,建立了檢測(cè) ARV抗體的間接 ELISA方法，確定了抗原最佳包被濃度為252 ug/mL，1%BSA封閉1.5h，血清最佳工作濃度為1∶160，37℃反應(yīng)1.5h，酶標(biāo)兔抗雞的稀釋度為1∶5000，37℃作用1h，底物37℃作用15min。所建立的方法與雞新城疫、傳染性支氣管炎、支原體的陽性血清無交叉反應(yīng)。

2013年謝志勤［6］等用克隆的雜交瘤細(xì)胞株制備 ARV的單克隆抗體，并用此抗體作為包被抗體，成功建立了雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)敏感性達(dá)到 5×10-5ug/uL的病毒。

2014年尹春紅［7］應(yīng)用純化的σB和σC蛋白作為包被抗原建立了ELISA檢測(cè)方法，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到抗體的產(chǎn)生及消長規(guī)律，可以用于ARV的臨床診斷和免疫監(jiān)測(cè)。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

目前,國內(nèi)外一些學(xué)者利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)ARV的檢測(cè)取得了很大進(jìn)展。試驗(yàn)證明，PCR試驗(yàn)檢測(cè)法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可診斷血清、感染組織中的ARV。

2013 年馬超英［8］根椐 GenBank中禽呼腸孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了兩種病毒的雙重RT-PCR。對(duì)同一樣品中的ARV、ALV核酸模板進(jìn)行雙重RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可同時(shí)擴(kuò)增ARV 485bp、ALV 673bp的特異性片段，而對(duì)其他5種禽病病原的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該雙重RT-PCR技術(shù)能檢出10pg的ALV和10pg的ARV模板。用31份臨床病料對(duì)本研究雙重RT-PCR技術(shù)和單項(xiàng)RT-PCR技術(shù)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果顯示，兩者的總符合率為100%。

2014年曹琛福［9］等建立實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)雞病毒性關(guān)節(jié)炎病原，針對(duì)特異性的禽呼腸孤病毒S1基因設(shè)計(jì)了1對(duì)引物及探針，建立了雞病毒性關(guān)節(jié)炎實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示：該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短，可應(yīng)用于雞病毒性關(guān)節(jié)炎的普查監(jiān)測(cè)和檢驗(yàn)檢疫。

2017年鐘麗［3］等建立的Real-time RT-PCR檢測(cè)方法，在1×1011×1010copies/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)到10 copies/μL，是常規(guī)PCR方法的100倍。

2018年鄭麗［10］等建立了ARV納米PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法特異性好，僅從ARV核酸樣品可檢測(cè)到約332bp的特異性目的條帶，而對(duì)新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒等其他11種病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該納米PCR方法能檢測(cè)到的最低核酸質(zhì)量濃度為56pg/L，其靈敏度是普通PCR的10倍。ARV核酸被重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果均一致。應(yīng)用建立的納米PCR和病毒分離鑒定方法對(duì)臨床送檢的30份樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的符合率為100%。

5 防治

目前國內(nèi)外尚沒有用于治療該病的方法，要以“預(yù)防為主，防治結(jié)合”為原則，做好各種免疫抑制病的預(yù)防接種工作，降低機(jī)體對(duì)禽呼腸孤病毒的易感性。

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期更換墊料，對(duì)雞舍內(nèi)外及飼養(yǎng)工具定期進(jìn)行消毒，消毒液可采用3%的火堿溶液進(jìn)行舍內(nèi)外消毒，或用0.5%有機(jī)碘液或百毒殺溶液1∶200稀釋帶雞噴霧消毒，飼養(yǎng)工具用10%的百毒殺等消毒藥物進(jìn)行清洗消毒。

本病應(yīng)以預(yù)防為主，疫苗免疫對(duì)預(yù)防雞病毒性關(guān)節(jié)炎效果明顯。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所成功研制雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、雞病毒性關(guān)節(jié)炎、雞傳染性法氏囊炎病四聯(lián)油乳劑滅活疫苗，適用于各種不同的蛋雞和肉雞，接種10d后產(chǎn)生免疫力，免疫期可達(dá)5個(gè)月。

2009年王存?zhèn)ィ?1］成功構(gòu)建了介導(dǎo)禽呼腸孤病毒σC基因疫苗的重組減毒沙門氏菌株，制備出禽呼腸孤病毒σC基因疫苗，應(yīng)用于雛雞，以 1.0×l09 CFU劑量 1次免疫6日齡雛雞，并于2周后進(jìn)行二免，結(jié)果顯示，免疫2周后 ，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ARVσC蛋白的特異血清Ig G抗體，差異顯著(P＜0.01)，二免后 3周進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，保護(hù)率可達(dá) 66.7%，重組減毒沙門氏菌株對(duì)雛雞具有良好的免疫原性和安全性。

2012年徐延偉［12］等根據(jù)已公布的禽呼腸孤病毒 S1133毒株σC基因克隆至p PIC9K酵母表達(dá)載體當(dāng)中，成功構(gòu)建了重組酵母菌株p PIC9K-σC/GS115。 將畢赤酵母表達(dá)的重組σC蛋白用法國佐劑乳化后，免疫3周齡 SPF雞，并進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，該重組σC蛋白可以阻止 ARV在體內(nèi)的復(fù)制，且能夠?qū)Ω腥静《具M(jìn)行清除。

2012年謝志勤［13］等構(gòu)建了含禽呼腸孤病毒S1133毒株的σ3基因重組質(zhì)粒 pc DNA3.1-σ3，免疫 7日齡SPF雛雞，同時(shí)設(shè)滅活 S1133、表達(dá)σ3蛋白及生理鹽水對(duì)照，二次加強(qiáng)免疫2周后，用S1133毒株進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明，pc DNA3.1-σ3處理 、滅活S1133處理 、表達(dá)σ3蛋白處理和生理鹽水處理的病毒檢出率分別為 7.4%、3.7%、11.1%、29.6% ，pc DNA-σ3處理與生理鹽水處理的差異顯著(P＜0.05)，但與滅活 S1133處理、表達(dá)σ3蛋白處理的差異不顯著(P＞0.05)。

另外，在診治時(shí)，盡管雞的病毒性關(guān)節(jié)炎病臨床癥狀明顯，但容易與其他疾病混淆，在診斷時(shí)，應(yīng)綜合流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化及實(shí)驗(yàn)室診斷的結(jié)果作出確診，及時(shí)進(jìn)行處置，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。