相關(guān)性miRNAs在骨肉瘤中作用的研究進(jìn)展

趙 珂，王文己，韓興文

(1.蘭州大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科 蘭州 730000)

骨肉瘤(OS)是起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年長骨的干骺端，以股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端最為常見；發(fā)病率約為4.4/100萬，在原發(fā)性骨腫瘤中排第二位[1]。骨肉瘤以產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征。目前骨肉瘤的治療以新輔助化療和手術(shù)治療為主，即便化療方案的不斷完善，以及影像學(xué)發(fā)展帶來的腫瘤邊界判斷和病情檢測水平的提高，其5年生存率仍然維持在60%～70%水平，無明顯提高[2]。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長度約18～25個核苷酸的非編碼RNA小分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后內(nèi)源性調(diào)控基因表達(dá)。腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)；miRNAs參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等不同階段，并密切相關(guān)[3]。骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制與基因突變、信號通路激活異常、miRNAs以及長鏈非編碼RNA的異常調(diào)控等諸多方面有關(guān)[4]。故而對miRNAs在骨肉瘤中作用的研究對骨肉瘤診斷與治療提供了新的研究方向。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路異常激活促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲。而miRNAs與Wnt信號通路異常激活密切相關(guān)。本文對miRNAs在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及在血清學(xué)層面等方面的研究進(jìn)展作一簡要綜述。

相關(guān)性miRNAs在骨肉瘤中作用的研究進(jìn)展

1 相關(guān)miRNAs在骨肉瘤中的差異性表達(dá)

骨肉瘤來源于多能干細(xì)胞(間質(zhì)干細(xì)胞)，而非分化異常的成骨細(xì)胞。間質(zhì)干細(xì)胞在向骨細(xì)胞分化的過程中出現(xiàn)基因遺傳學(xué)的改變而分化成異常的骨肉瘤細(xì)胞[5]。目前的研究已證實，miRNAs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)存在明顯差異性。與正常細(xì)胞相比，相關(guān)miRNAs表達(dá)水平出現(xiàn)增高或降低，同時大量研究結(jié)果揭示相關(guān)性miRNAs在骨肉瘤組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的上升與下降與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展等進(jìn)程密切相關(guān)，miRNAs表達(dá)譜的差異性分析為相關(guān)性miRNAs在骨肉瘤中作用的闡述提供了依據(jù)。

近期1項研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞中染色體14q32區(qū)的miR- 369- 3p、miR- 382、miR- 134和miR- 127- 3p表達(dá)減少，miR- 17- 5p、17- 3p、18a和19a表達(dá)增加[6]。另1項關(guān)于miRNA- 145在骨肉瘤中的表達(dá)情況的實驗中，通過RT-qPCR技術(shù)檢測166例骨肉瘤組織及正常無瘤骨組織中miR- 145的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常無瘤骨組織相比，miR- 145在骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)。166組標(biāo)本根據(jù)miR- 145表達(dá)水平的高低分為兩組，統(tǒng)計學(xué)分析表示，miR- 145相對高表達(dá)的患者多處于臨床早期，腫瘤無明顯遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對化療敏感，總體生存期更長；而miR- 145低表達(dá)的患者多處于臨床晚期，腫瘤多伴有明顯遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時對化療效果差，總體生存期更短[7]。這是第一次有明確證據(jù)證明miR- 145的低表達(dá)與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移及化療抵抗相關(guān)，miR- 145有望成為判斷骨肉瘤預(yù)后的獨立標(biāo)志物及靶向治療的靶點。在1項關(guān)于3AB-OS骨肉瘤細(xì)胞株中189種miRNAs的表達(dá)情況的實驗中，發(fā)現(xiàn)152種miRNAs表達(dá)水平與正常細(xì)胞相比出現(xiàn)明顯差異，其中46個具有明顯差異的miRNAs及其受其調(diào)控的靶基因與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，以及Wnt和MAPK等信號通路密切相關(guān)[8]。

2 miRNAs與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展

miRNAs已經(jīng)成為目前骨肉瘤分子生物學(xué)研究的熱點及重點。miRNAs在骨肉瘤中作用的研究才剛剛起步，一些miRNAs在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的一些調(diào)節(jié)機(jī)制及相應(yīng)靶點已被發(fā)現(xiàn)。部分miRNAs促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而部分則起抑制作用。這些miRNAs的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制的研究為骨肉瘤的研究開辟了新的鄰域。

2.1 促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)miRNAs

在骨肉瘤細(xì)胞組織中，起致癌作用的miRNAs通常表達(dá)上調(diào)，其靶向抑制抑癌基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近期1項實驗研究中，miR- 21被轉(zhuǎn)染至U2OS和MG- 63兩種骨肉瘤細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力較未轉(zhuǎn)染的對照組明顯增強；同時轉(zhuǎn)染反義miRNA- 21的細(xì)胞其細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。人骨肉瘤細(xì)胞增殖過程中miRNA- 21是通過抑制反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸(RECK)蛋白的表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。miR- 21的異常高表達(dá)抑制了RECK的抑癌作用，而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖[9]。另1項關(guān)于miRNA- 421在骨肉瘤中作用研究發(fā)現(xiàn)，miRNA- 421在骨肉瘤中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；過度高表達(dá)的miRNA- 421通過抑制抑癌基因MAP2K4起促進(jìn)MG- 63細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用；同時臨床研究也表明與低表達(dá)的患者相比，血清中高表達(dá)的骨肉患者總體生存期更短[10]。

2.2 抑制骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)miRNAs

在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)，起抑癌作用的miRNAs通常表達(dá)下調(diào)，而其抑癌作用的機(jī)制研究為骨肉瘤基因治療提供潛在的靶點。1項研究發(fā)現(xiàn)，與瘤旁組織相比，原發(fā)性骨肉瘤組織中，miRNA- 143呈現(xiàn)明顯低表達(dá)；而將miRNA- 143轉(zhuǎn)染至MG- 63細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)miRNA- 143后誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。在此基礎(chǔ)上，近期的1項分子生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA- 143的表達(dá)與抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤- 2蛋白(BCL- 2)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；miRNA- 143直接靶向作用于BCL- 2蛋白，抑制其抗凋亡作用而發(fā)揮促凋亡作用[12]。miRNA- 143與BCL- 2之間的相互作用機(jī)制為骨肉瘤基因治療提供了潛在靶點。另1項關(guān)于miRNA- 130a在骨肉瘤中作用的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA- 643在骨肉瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miRNA- 130a的細(xì)胞增殖、侵襲能力顯著降低；miRNA- 643的直接作用靶點為癌基因ZEB1，抑制ZEB1能起到與miRNA- 130a相同的作用[13]。由此可見，miRNA- 130a靶向作用ZEB1而起抑癌基因的作用，miRNA- 643與ZEB1之間復(fù)雜的作用關(guān)系可成為骨肉瘤的潛在治療靶點。

總之，大量的miRNAs研究已證實，部分miRNAs促進(jìn)了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展；同時一部分miRNAs則起抑制作用[6，14]。但是，目前miRNAs對骨肉瘤的調(diào)控的具體機(jī)制研究才剛剛起步，促癌基因與抑癌基因之間相互的作用關(guān)系，以及促/抑癌基因與其相對應(yīng)的靶基因之間相互作用的機(jī)制構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍待進(jìn)一步發(fā)掘與研究。

3 miRNAs與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移

骨肉瘤早期就會出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且以肺轉(zhuǎn)移為主，病情惡化迅速，病死率較高。確診骨肉瘤時，約有半數(shù)的患者已出現(xiàn)不同程度的肺轉(zhuǎn)移。單純的手術(shù)治療無法避免骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且骨肉瘤一旦發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，其5年生存率在20%～ 25%[16]。而近年來的研究指出，大量的miRNAs與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞運動、胞間黏附、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用密切相關(guān)[17]。因此，研究與骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，特別是與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs以及其相對應(yīng)的靶基因并調(diào)控機(jī)制，對控制骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特別是肺轉(zhuǎn)移的靶向治療以及改善患者術(shù)后，提高患者生存率具有重大意義。

肺轉(zhuǎn)移是血道轉(zhuǎn)移最常見的部位之一。骨肉瘤瘤體周圍豐富的血供及供養(yǎng)血管的形成是早期血道轉(zhuǎn)移發(fā)生的先決條件。而腫瘤細(xì)胞促進(jìn)新毛細(xì)血管的生成與其分泌的腫瘤血管生長因子(VEGFA)密切相關(guān)。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miRNA- 1表達(dá)下調(diào)，并與VEGFA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過雙熒光素酶報告基因檢測顯示VEGFA是miRNA- 1的直接作用靶點；當(dāng)siRNA敲除miRNA- 1后VEGFA表達(dá)上調(diào)并抑制U2OS細(xì)胞的遷移與體外遷移[18]。

Wnt通路機(jī)制在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本課題組經(jīng)過體外細(xì)胞株實驗發(fā)現(xiàn)，使用Wnt通路阻滯劑(icrt- 14及XAV- 939)阻斷Wnt通路時，骨肉瘤MG- 63及U2OS細(xì)胞株增殖及遷移侵襲出現(xiàn)明顯的抑制，表明Wnt/β-catenin通路與骨肉瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近期1項關(guān)于miRNA- 214的實驗研究發(fā)現(xiàn)，被轉(zhuǎn)染miRNA- 214的MG- 63及U2OS細(xì)胞株內(nèi)Wnt通路的下游蛋白β-catenin表達(dá)異常上升，同時細(xì)胞遷移及體外侵襲能力均強于對照組[19]。由此可見miRNA- 214通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。而近期另1項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA- 107在骨肉瘤組織中低表達(dá)，而DKK- 1表達(dá)上調(diào)；miRNA- 107通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路下調(diào)DKK- 1的表達(dá)起抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移[20]。上述兩項研究表明，miRNAs與骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制相關(guān)信號通路的異常激活密切相關(guān)，這為靶向治療骨肉瘤轉(zhuǎn)移，提高患者生存率提供了靶點。

目前關(guān)于骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的miRNAs研究才剛剛起步，促進(jìn)轉(zhuǎn)移與抑制轉(zhuǎn)移的相關(guān)性miRNAs間相互作用的關(guān)系機(jī)制仍不十分清楚。大量與骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs正不斷被人們發(fā)現(xiàn)與研究，這為控制骨肉瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高患者生存率提供了新的靶點發(fā)方向。

4 外周血中miRNAs與骨肉瘤

4.1 外周血中miRNAs的表達(dá)與檢測方法

通過手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)檢查存在明顯局限性，因而患者外周血中核酸分子(CNA)的檢測成為了研究的熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs不僅只存在于組織細(xì)胞內(nèi)，在包括血清、血漿、唾液、尿液、精液及乳汁等各種體液或分泌物中都有發(fā)現(xiàn)[21]。而且外周血中的miRNAs在反復(fù)凍存-解凍，煮沸，過酸(pH=2)和過堿(pH=13)等條件下，均能保持濃度和生物活性穩(wěn)定[22]，這為外周血中miRNAs替代組織標(biāo)本成為新型檢測指標(biāo)提供了依據(jù)。

目前miRNAs的檢測方法有：Northern印記雜交、RT-qPCR、基因芯片等技術(shù)，其中RT-qPCR應(yīng)用最廣泛。PT-qPCR技術(shù)是指將熒光基因加入PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號的積累來監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。該方法可區(qū)別前體miRNAs與成熟miRNAs。血液中miRNAs的檢測最常使用該種方法。

4.2 外周血中miRNAs在骨肉瘤中的意義

目前大量研究表明，檢測外周血中骨肉瘤相關(guān)mRNAs表達(dá)水平，為疾病早期診斷及病情進(jìn)展監(jiān)測提供了更加方便快捷的手段，具有重要意義。1項關(guān)于20例骨肉瘤患者以及20名健康對照者血清中miRNAs的表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 106a- 5p、miR- 16- 5p、miR- 30a- 5p、miR- 425- 5p、miR- 45- 1a、miR- 25- 3p和miR- 139- 5p在骨肉瘤患者血清中呈現(xiàn)異常低表達(dá)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析這7種miRNAs表達(dá)有望成為骨肉瘤早期診斷、病情檢測的無創(chuàng)性標(biāo)志物[23]。另1項關(guān)于骨肉瘤患者術(shù)前、術(shù)后及健康對照者血清中miRNA- 199a- 3p的表達(dá)水平的研究中，90名骨肉瘤術(shù)前患者和50例術(shù)后1月及90名健康對照血清中miRNA- 199a- 3p的表達(dá)水平顯示，骨肉瘤患者血清中miRNA- 199a- 3p的表達(dá)明顯上升，并且術(shù)后一月的患者血清中濃度較術(shù)前患者明顯下降，提示血清中miRNA- 199a- 3p有望成為骨肉瘤早期診斷與病情監(jiān)測的新型指標(biāo)[24]。與正?；颊呦啾?，骨肉瘤患者外周血中相關(guān)miRNAs組成和濃度的差異性表達(dá)為外周血中相關(guān)miRNAs成為骨肉瘤早期診斷、預(yù)后判斷和病情分析的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物提供了依據(jù)。

5 小結(jié)與展望

miRNAs與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后息息相關(guān)，并在其中發(fā)揮著重要作用。miRNAs在骨肉瘤組織細(xì)胞中的差異性表達(dá)為骨肉瘤早期診斷及治療提供新的作用靶點。通過研究藥物影響miRNAs在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)而影響腫瘤的病情進(jìn)程與預(yù)后，為研究分子靶向類藥物治療骨肉瘤提供了新的方向。近年來，隨著大量miRNAs的發(fā)現(xiàn)，其生物合成、生物學(xué)功能、作用機(jī)制與疾病的相關(guān)性研究已取得一定的成果，特別是miRNAs在腫瘤疾病中的研究取得了很大的進(jìn)展。但必須認(rèn)識到miRNAs與骨肉瘤的研究還面臨很多的難題和空白。首先還有大量與骨肉瘤相關(guān)的miRNAs和靶基因，以及之間的功能與作用途徑未知；其次miRNAs與靶基因之間控制調(diào)節(jié)和多個miRNAs之間的相互調(diào)控以及反饋機(jī)制未知；還有miRNAs與骨肉瘤相關(guān)的各種信號通路之間作用關(guān)系，及多種miRNAs對一種信號通路的協(xié)調(diào)控制機(jī)制，以及反饋機(jī)制尚不明確?？傊?，miRNAs與骨肉瘤之間關(guān)系的探索為骨肉瘤臨床的早期診斷、分子靶向治療、預(yù)后判定提供了新的思路和挑戰(zhàn)。