不同固定液在細(xì)胞蠟塊技術(shù)中的應(yīng)用

王敏，虞繼紅，賀吉，余波

脫落細(xì)胞學(xué)檢查是病理診斷常規(guī)方法之一，常規(guī)的細(xì)胞學(xué)涂片常因細(xì)胞量少、細(xì)胞發(fā)生變性及涂片厚薄不均等因素影響，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷的陽性率較低，易發(fā)生漏診；且僅根據(jù)涂片上有限的腫瘤細(xì)胞，不易判斷腫瘤細(xì)胞的來源，也無法進(jìn)行一些后續(xù)的檢測手段，如免疫組化及基因檢測等。然而將臨床上最常見的脫落細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本胸腹水制作成細(xì)胞蠟塊，可明顯提高細(xì)胞病理診斷的敏感性和特異性，而且對于部分獲取病理組織困難者意義較大。細(xì)胞蠟塊制作方法多種，所用固定液也多種，為尋找制作細(xì)胞蠟塊最佳的固定液，本文采用3種病理科常用的固定液，對同一細(xì)胞涂片陽性的漿膜腔液體進(jìn)行細(xì)胞蠟塊制作，發(fā)現(xiàn)12%中性甲醛固定效果最佳?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 收集2018年1—6月寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院病理科腫瘤性胸腹水10例，細(xì)胞學(xué)涂片診斷明確見到癌細(xì)胞。按需要選擇 CK（pan）、CK7、CEA、TTF-1、p63、CD56及Syn等抗體，一抗試劑為福州邁新公司，二抗及顯色液為DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞蠟塊制備方法 （1）臨床送檢新鮮胸腹水，通過常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片診斷見到癌細(xì)胞的病例，用標(biāo)1、2、3三個50m l尖底離心管各取約40 m l胸水，離心速度3 000 r/m in，離心10 m in，棄上清，若細(xì)胞量過少，可以采取多次離心棄上清，保留沉淀物。若胸腹水為血性標(biāo)本，建議用冰醋酸酒精液（25m l酒精+10m l冰醋酸+65 m l水）去除紅細(xì)胞；具體操作方法如下：先將胸腹水置于離心管中進(jìn)行首次離心，棄去上清，再將冰醋酸酒精液置入離心管中，混勻，進(jìn)行再次離心，棄上清，隨后向離心管中加入相應(yīng)的固定液。（2）1管加入12%中性甲醛、2管加入95%乙醇、3管中加入甲醇各10 m l。（3）震蕩，靜置1h左右，再離心，棄上清。（4）用吸管將離心管底部的細(xì)胞吸取到顯微鏡擦鏡紙上，包好，放入盛有12%中性甲醛標(biāo)本盒中1 h，與常規(guī)組織取材后，一起放入自動脫水機(jī)中進(jìn)行組織處理，待組織處理結(jié)束，取出組織塊，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制作成細(xì)胞蠟塊。

1.2.2 切片與烤片 將細(xì)胞蠟塊放入冰箱冷凍室放置5～10 min，進(jìn)行常規(guī)切片數(shù)張，切片厚度為4 m，置入65℃烤箱烤片1.5 h。

1.2.3 HE染色和免疫組織化學(xué)染色一張切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，其余數(shù)張切片根據(jù)不同需要進(jìn)行相應(yīng)的免疫組織化學(xué)抗體染色，根據(jù)一抗需要選擇不同的修復(fù)液，按照一抗及二抗試劑說明書進(jìn)行EnVision染色法，DAB顯色完成后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察HE切片結(jié)果 采用12%中性甲醛固定的細(xì)胞塊，細(xì)胞排列方式明顯可見，細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞輪廓清晰，胞核明顯可見，腫瘤細(xì)胞與周圍正常間皮細(xì)胞、組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)形成鮮明對比，異型腫瘤細(xì)胞核仁較明顯，背景干凈，染色鮮艷（封四彩圖6）；采用95%乙醇、甲醇固定的HE切片染色效果相似，細(xì)胞排列方式不易辨認(rèn)，細(xì)胞形態(tài)稍有退變，細(xì)胞輪廓欠清晰，胞漿淡染，空泡化明顯，核保存欠佳，部分核體積增大，部分核固縮，染色不鮮艷（封四彩圖7）。

2.2 免疫組化標(biāo)記結(jié)果 3種固定液固定的漿膜腔積液在相同腫瘤中均呈陽性，但12%中性甲醛固定的細(xì)胞蠟塊的免疫標(biāo)記染色效果最好，標(biāo)記清晰，背景干凈（封四彩圖8～9）；95%乙醇、甲醇固定液固定的細(xì)胞蠟塊免疫標(biāo)記染色效果欠佳，標(biāo)記稍減弱（封四彩圖10～11）。

3 討論

目前針對臨床上送檢的漿膜腔積液，處理方法通常為2種，一種是采用細(xì)胞學(xué)涂片，其缺點是細(xì)胞采集量少，且涂片易厚薄不均，制片質(zhì)量與人員的技術(shù)水平關(guān)系密切，易受多種因素影響，從而影響病理診斷；另一種是采用液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)，此方法改善了細(xì)胞學(xué)制片質(zhì)量，但標(biāo)本失去了細(xì)胞排列方式和背景細(xì)胞，對可疑和高分化癌細(xì)胞以及反應(yīng)性間皮細(xì)胞和間皮瘤不易鑒別[1]，且成本較高，檢查費用昂貴，在許多小型醫(yī)院無法開展。而細(xì)胞蠟塊技術(shù)的應(yīng)用，使細(xì)胞有組織學(xué)形態(tài)，保存了細(xì)胞的排列方式，且細(xì)胞蠟塊可進(jìn)行多次切片，用于其他多種項目的檢測，如特殊染色，免疫組織化學(xué)染色等，進(jìn)一步提高了細(xì)胞學(xué)診斷的陽性率，還可以判斷細(xì)胞的來源、分型及評估患者預(yù)后[2]。

臨床上細(xì)胞蠟塊制作方法有多種[3-4]，但是對于不同固定液對漿膜腔積液制作細(xì)胞蠟塊效果影響的文章較少見。本文應(yīng)用臨床上最常見的3種固定液（12%中性甲醛，95%乙醇、甲醇）對漿膜腔積液細(xì)胞制作為細(xì)胞蠟塊時進(jìn)行固定，觀察此3種固定液對細(xì)胞蠟塊HE染色及免疫組織化學(xué)染色效果的影響.實驗結(jié)果得出12%中性甲醛固定液的固定效果最好，HE染色鮮艷，細(xì)胞形態(tài)完好，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果清晰，易判；而95%乙醇和甲醇的固定效果欠佳，HE染色顏色不鮮艷，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞空泡化明顯，部分核固縮，部分核體積增大，免疫組織化學(xué)染色抗體標(biāo)記減弱，部分抗原丟失。

在制作細(xì)胞蠟塊過程中，采用12%中性甲醛固定離心后，細(xì)胞不易凝結(jié)在一起，不利于包埋，此時盡可能將試管中的液體取出，用吸管將細(xì)胞沉淀物吸出，置于玻片上，周圍液體用濾紙吸干，向細(xì)胞沉淀物上滴上幾滴95%乙醇，細(xì)胞沉淀凝固成塊，易制作成細(xì)胞蠟塊。95%乙醇與甲醇兩者固定較迅速，細(xì)胞容易結(jié)成塊，利于細(xì)胞蠟塊制作。

綜上所述，本文通過比較病理科常用的3種固定液在細(xì)胞塊制作技術(shù)中的效果，得出12%中性甲醛效果最佳，不僅完好的保存了細(xì)胞形態(tài)，而且對抗原影響較小，得到了較滿意的細(xì)胞蠟塊HE和免疫組化染色結(jié)果，因此采用12%中性甲醛制作細(xì)胞蠟塊的技術(shù)值得推廣。