具有人紅細(xì)胞重建的人源化小鼠模型構(gòu)建和應(yīng)用的研究進(jìn)展

范 偉，楊永廣，胡 正

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院/免疫學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春130061)

小鼠作為一種常用的模式動(dòng)物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。早在17世紀(jì)小鼠就被作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，現(xiàn)已成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。然而，許多藥物或治療方案在普通小鼠模型中驗(yàn)證有效之后，在臨床試驗(yàn)中卻有超過80%的失敗率[1]。小鼠和人之間巨大的進(jìn)化差異是導(dǎo)致普通小鼠模型無法準(zhǔn)確反映人生理和病理情況，并預(yù)測(cè)藥物的臨床療效的主要原因。因此，構(gòu)建能夠直接反映人類生理、病理狀況的新型小鼠模型對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步具有重要意義，而人源化小鼠就是在這種環(huán)境下應(yīng)運(yùn)而生[2]。具有人造血免疫系統(tǒng)的人源化小鼠即造血免疫系統(tǒng)人源化小鼠，是目前最為成熟且應(yīng)用最為廣泛的一類人源化小鼠模型。

1 造血免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型及其人紅細(xì)胞發(fā)育情況

1988年McCune等[3]將人的胎肝造血干細(xì)胞、胚胎胸腺及淋巴結(jié)移植入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中建立了第1個(gè)人源化小鼠模型，即SCID-hu小鼠。同年8月，PBL-SCID小鼠模型誕生，該小鼠是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞輸注入SCID小鼠中再造出人類免疫系統(tǒng)[4]。SCID小鼠的T細(xì)胞和B細(xì)胞幾乎完全缺陷，但小鼠自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)等其他天然免疫細(xì)胞還會(huì)高效殺傷人類細(xì)胞，嚴(yán)重影響基于SCID小鼠構(gòu)建的人源化小鼠中人細(xì)胞的水平[2]。1995年NOD/SCID品系小鼠成功建立，NK細(xì)胞殺傷功能明顯降低且巨噬細(xì)胞幾乎不排斥人類細(xì)胞，是用于構(gòu)建人源化小鼠模型的理想小鼠品系[5]。Lan等[6]通過在NOD/SCID小鼠上移植人胚胎胸腺和肝臟及造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)構(gòu)建了具有人免疫系統(tǒng)功能的人源化小鼠模型，又被稱為BLT模型，被認(rèn)為是活體研究人免疫系統(tǒng)及人免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的最優(yōu)動(dòng)物模型之一，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域[7]。在NOD/SCID小鼠基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展出的NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的NK細(xì)胞完全缺陷，被認(rèn)為是目前用于人源化小鼠模型構(gòu)建的最佳受體之一[2]。

2005年 Ishikawa等[8]通過臉靜脈給新生NOD/SCID IL2rg-/-小鼠注射人臍帶血CD34+細(xì)胞，構(gòu)建了具有人T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等免疫細(xì)胞的人源化小鼠模型，且在其外周血中檢測(cè)到人Glycophorin A+紅細(xì)胞。研究[9]顯示：基于NOD/SCID小鼠和NOD/SCID IL2rg-/-小鼠建立的所有人源化小鼠的外周血中均無法檢測(cè)到人紅細(xì)胞，但其骨髓中卻有大量人紅系細(xì)胞，骨髓中未成熟的人紅細(xì)胞的嵌合比例和人白細(xì)胞嵌合比例幾乎無差別；但成熟人紅細(xì)胞嵌合比例卻遠(yuǎn)低于人白細(xì)胞的嵌合比例，表明某些因素阻礙了人源化小鼠模型中人紅細(xì)胞的重建。

2 造血免疫系統(tǒng)人源化小鼠人紅細(xì)胞發(fā)育障礙的原因

2.1 網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)不兼容本課題組前期研究[9]表明：小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬是導(dǎo)致人紅細(xì)胞無法在免疫缺陷小鼠中存活的主要原因之一。應(yīng)用脂質(zhì)體包載的氯膦酸二鈉(clodronate-liposome,CLD-liposome)清除小鼠巨噬細(xì)胞可以提高輸注免疫缺陷小鼠中的人紅細(xì)胞的生存時(shí)間，注射CLD-liposome的人源化小鼠的外周血中檢測(cè)到Glycophorin A+CD71—無核的成熟人紅細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用人白細(xì)胞介素3(interleukin-3,IL-3)和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)能明顯提高人紅細(xì)胞的重建比例[10-11]。但外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞占人紅細(xì)胞比例的10%～30%，明顯高于正常人外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的比例[10]。這可能與巨噬細(xì)胞完全清除有關(guān)，因?yàn)榧t細(xì)胞的發(fā)育成熟脫核的過程需要巨噬細(xì)胞的參與，且巨噬細(xì)胞分泌的自身合成的鐵蛋白能夠促進(jìn)紅細(xì)胞的成熟和分化[12]。由于缺乏可用的動(dòng)物模型和有效的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段，紅細(xì)胞去核機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

2.2 CD47-信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(Sirpα)信號(hào)通路的異常CD47是一類廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的蛋白分子，可調(diào)節(jié)具有吞噬功能免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和DC)的吞噬作用。CD47與其配體Sirpα結(jié)合會(huì)傳導(dǎo)一個(gè)“Don’t eat me”的免疫抑制信號(hào)[13]，在異種移植中，由于供者CD47與受者Sirpα之間的不匹配導(dǎo)致移植物被受體巨噬細(xì)胞排斥[14]，可能限制了人細(xì)胞在小鼠中的重建。NOD背景的免疫缺陷小鼠比較特殊，與其他品系小鼠比較，人CD47與NOD小鼠的Sirpα親和力高出65倍，其原因是NOD小鼠的Sirpα在1結(jié)構(gòu)域中缺少2個(gè)氨基酸，所以NOD背景小鼠比其他品系小鼠有更好的植入背景[15]。在NOD/SCID小鼠中1∶1轉(zhuǎn)輸CD47KO小鼠紅細(xì)胞及人紅細(xì)胞后，NOD/SCID小鼠排斥人紅細(xì)胞的速度明顯快于CD47KO小鼠，說明NOD/SCID小鼠排斥人紅細(xì)胞不是因?yàn)镃D47-Sirpα信號(hào)通路缺失[11]。隨著對(duì)紅細(xì)胞發(fā)育研究的深入，報(bào)道[16]指出：CD47在衰老和氧化紅細(xì)胞上的表達(dá)水平及膜上分布出現(xiàn)異常，會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬，推測(cè)小鼠吞噬人紅細(xì)胞可能與人紅細(xì)胞在小鼠體內(nèi)被氧化或快速衰老有關(guān)。

2.3 補(bǔ)體的調(diào)理作用目前應(yīng)用于人源化的受者小鼠多為NOD背景的免疫缺陷小鼠，該小鼠優(yōu)勢(shì)不僅在于其Sirpα與人CD47有交叉反應(yīng)，而且該種小鼠補(bǔ)體系統(tǒng)不健全。NOD背景小鼠補(bǔ)體C5缺陷，因此不能形成膜攻擊復(fù)合體介導(dǎo)溶細(xì)胞效應(yīng)[17]。一般認(rèn)為，NOD/SCID及NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的補(bǔ)體系統(tǒng)不會(huì)介導(dǎo)對(duì)植入人細(xì)胞的排斥。研究[18]表明：NOD背景免疫缺陷小鼠中的補(bǔ)體C3可以在無抗體的情況下直接結(jié)合并調(diào)理人紅細(xì)胞，介導(dǎo)小鼠吞噬細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)對(duì)人紅細(xì)胞的排斥作用；在CLD-lipsome處理的人源化小鼠中，聯(lián)合注射眼鏡蛇毒因子(Cobra venom factor，CVF)(清除小鼠補(bǔ)體C3)能夠?qū)⑷嗽椿∈笸庵苎腥思t細(xì)胞的重建水平提高約2倍,說明人紅細(xì)胞在小鼠體內(nèi)被清除與小鼠補(bǔ)體有關(guān)。

2.4 小鼠淋巴造血因子和人細(xì)胞交叉反應(yīng)缺失紅細(xì)胞在骨髓中的分化發(fā)育依賴一系列細(xì)胞因子作用完成，例如IL-3和EPO[19]。研究[20]表明：小鼠IL-3和人IL-3之間的同源性較低，無法作用于人類細(xì)胞。EPO在低氧條件下由腎臟產(chǎn)生，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的產(chǎn)生[21]，其小鼠和人之間的交叉反應(yīng)也不明確。研究[22]表明：通過給人源化小鼠高壓注射含有人IL-3和EPO基因的質(zhì)粒，4周后可在人源化小鼠外周血中檢測(cè)到少量人紅細(xì)胞重建。與此類似，在CLD-liposome處理的人源化小鼠體內(nèi)同時(shí)注射人IL-3和EPO可以將人紅細(xì)胞的嵌合比例提高約5倍[9]。因此，小鼠和人之間淋巴造血因子交叉反應(yīng)缺失或不足也是限制人源化小鼠中人紅細(xì)胞重建的原因之一。

2.5 骨髓微環(huán)境造血干細(xì)胞在骨髓中向紅細(xì)胞分化發(fā)育除了與淋巴造血因子有關(guān)外，也與骨髓基質(zhì)細(xì)胞等提供的骨髓微環(huán)境有直接關(guān)系[23]。小鼠骨髓微環(huán)境與人骨髓微環(huán)境不盡相同，所以人造血干細(xì)胞的一些屬性無法在人源化小鼠中體現(xiàn)，例如人造血干細(xì)胞無法在免疫缺陷小鼠中實(shí)現(xiàn)連續(xù)移植。人造血干細(xì)胞較小鼠造血干細(xì)胞在小鼠骨髓造血龕(Niche)的競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)也被認(rèn)為是影響人源化小鼠骨髓中人造血干細(xì)胞定向分化的原因之一[24]。c-kit基因?qū)儆诶野彼峒っ甘荏w蛋白家族的重要成員之一，通過與干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)結(jié)合激活一系列信號(hào)通路，參與造血干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控。c-kit基因某些突變(如c-kit/W41)會(huì)導(dǎo)致自身造血干/祖細(xì)胞對(duì)造血龕提供的SCF(c-kit的配體)的作用能力減弱，降低小鼠造血干細(xì)胞對(duì)自身造血龕的競(jìng)爭(zhēng)能力[24]。因此，c-kit/W41突變的免疫缺陷小鼠(如NSGW41)可以在非照射條件下直接注射人HSC實(shí)現(xiàn)較高水平人造血免疫細(xì)胞的重建[24]。在NSGW41背景的人源化小鼠骨髓中多個(gè)分化階段人紅系細(xì)胞(包括Pro-E、Int-E/Late-E和Retic/RBC)的嵌合比例均明顯高于基于NSG的人源化小鼠，與人骨髓中的紅系細(xì)胞組成情況十分相似[25]。Fiorini等[26]利用NBSGW小鼠對(duì)人紅細(xì)胞在各發(fā)育階段的形態(tài)分析、表面表型等方面進(jìn)行充分表征，結(jié)果表明：優(yōu)化小鼠骨髓中人造血干/祖細(xì)胞的骨髓微環(huán)境，有助于人紅細(xì)胞的分化發(fā)育。

3 具有人紅細(xì)胞組成的人源化小鼠模型的構(gòu)建

按照模型構(gòu)建的方法劃分，紅細(xì)胞人源化小鼠模型的構(gòu)建方法大致可分為3類：模型Ⅰ，通過注射CLD-liposome等試劑抑制人紅細(xì)胞免疫排斥建立的模型[9]；模型Ⅱ，通過高壓注射含有人IL-3和EPO基因質(zhì)粒促進(jìn)人紅細(xì)胞骨髓分化建立的模型[22]；模型Ⅲ，通過反復(fù)注射大量人紅細(xì)胞抵消小鼠吞噬反應(yīng)建立的模型[27]。

3.1 通過注射CLD-liposome等試劑抑制人紅細(xì)胞免疫排斥所建立的模型吞噬細(xì)胞對(duì)人紅細(xì)胞的排斥是導(dǎo)致人源化小鼠中人紅細(xì)胞缺陷的最主要原因之一。因此，在造血免疫系統(tǒng)人源化小鼠體內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射小劑量CLD-liposome即可實(shí)現(xiàn)約4%的人紅細(xì)胞重建[11]。聯(lián)合應(yīng)用CLD-liposome和CVF可將外周血人紅細(xì)胞重建的比例再提高約1倍[18]。中性粒細(xì)胞也是一類具有吞噬能力的免疫細(xì)胞，CLD-liposome無法清除中性粒細(xì)胞，因此研究者通過注射抗中性粒細(xì)胞的抗體來阻斷中性粒細(xì)胞的吞噬作用[10]，聯(lián)合CLD-liposome也可以提高外周血中人紅細(xì)胞的重建。另外，在CLD-liposome處理小鼠體內(nèi)注射人細(xì)胞因子IL-3和EPO能實(shí)現(xiàn)較高水平的人紅細(xì)胞重建(約25%)[22]。該模型優(yōu)勢(shì)在于由人造血干細(xì)胞發(fā)育而來的人紅細(xì)胞能更好地模擬紅細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，且人免疫系統(tǒng)與紅細(xì)胞為同一供者來源。

3.2 通過高壓注射含有人IL-3和EPO基因質(zhì)粒所建立的模型紅細(xì)胞分化發(fā)育所需細(xì)胞因子信號(hào)缺失或不足是人源化小鼠中人紅細(xì)胞發(fā)育效率低的原因之一[22]。直接注射可溶性細(xì)胞因子IL-3和EPO有利于人紅細(xì)胞的生成，但需多次給藥，操作較為復(fù)雜。因此可通過構(gòu)建含有人IL-3和(或)EPO基因的表達(dá)質(zhì)粒[22]，利用高壓注射的手段將其注入人源化小鼠體內(nèi)，使小鼠細(xì)胞大量表達(dá)并分泌該細(xì)胞因子，以供人紅細(xì)胞分化發(fā)育所用[22]。但是，由于單獨(dú)高壓注射IL-3/EPO質(zhì)粒并未克服小鼠吞噬細(xì)胞對(duì)人紅細(xì)胞的強(qiáng)烈排斥作用，人源化小鼠中人紅細(xì)胞的重建水平較低(1%～4%)[10]。

3.3 通過輸注過量人紅細(xì)胞抵消小鼠吞噬反應(yīng)所建立的模型該方法需要頻繁輸注人紅細(xì)胞來維持小鼠體內(nèi)紅細(xì)胞水平，多用于瘧疾感染模型[28]。該模型的缺點(diǎn)是其外周血中人紅細(xì)胞來源于回輸入小鼠體內(nèi)的成熟人紅細(xì)胞而不是由小鼠骨髓中的人造血干細(xì)胞分化而來，因此無法用于研究人紅細(xì)胞的分化發(fā)育過程以及相關(guān)疾病(如遺傳導(dǎo)致的貧血)；另外，該方法操作較為復(fù)雜，需要每天注射大量人紅細(xì)胞以維持人紅細(xì)胞水平[27]。

4 具有人紅細(xì)胞組成的人源化小鼠模型的應(yīng)用

紅細(xì)胞是血液中的主要成分，主要負(fù)責(zé)氧氣運(yùn)輸。據(jù)估計(jì)，成年人每秒能產(chǎn)生240 000個(gè)新生紅細(xì)胞。而如此大量的人紅細(xì)胞更新主要依賴于極少量定居于骨髓的造血干細(xì)胞通過紅細(xì)胞造血(erythropoiesis)過程實(shí)現(xiàn)[29]。該過程中微小的基因異常均可能導(dǎo)致嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病，例如β-地中海貧血和鐮刀狀紅細(xì)胞貧血等，目前除了異體骨髓移植外并無有效的根治方法[30]，而異體骨髓移植會(huì)帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如移植物抗宿主疾病(GVHD)。近年來，以胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞為代表的干細(xì)胞技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。2008年Lu等[31]利用胚胎干細(xì)胞在體外分化出無核成熟的紅細(xì)胞；2017年Sugimura等[32]將人多能干細(xì)胞分化成人造血干細(xì)胞，其能夠在人源化小鼠體內(nèi)分化成脫核的人紅細(xì)胞。另一方面，以CRISPER-Cas9技術(shù)為代表的基因編輯技術(shù)也使通過基因編輯根治遺傳性貧血成為可能[33]。具有人紅細(xì)胞重建的人源化小鼠模型為上述技術(shù)的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了理想的研究和檢驗(yàn)平臺(tái)[11]。

人紅細(xì)胞可成為某些病原微生物(如瘧原蟲)的侵襲對(duì)象[34]。迄今為止，針對(duì)瘧疾的有效疫苗仍然未研制成功[35]。由于瘧原蟲感染具有宿主特異性的特點(diǎn)，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無法模擬人類瘧原蟲感染。目前研究瘧疾多選用感染嚙齒類動(dòng)物的瘧原蟲感染小鼠或大鼠，間接研究人類瘧疾感染機(jī)制及治療策略，無法準(zhǔn)確反映瘧疾患者的實(shí)際情況[36]。Chen等[27]研究瘧疾感染過程結(jié)果顯示：人NK細(xì)胞優(yōu)先與被感染的紅細(xì)胞相互作用，從而清除被感染的紅細(xì)胞。該模型的缺點(diǎn)是人紅細(xì)胞為異體來源，且需要反復(fù)、大量注射，小鼠巨噬細(xì)胞會(huì)不斷吞噬輸入的人紅細(xì)胞(包括被瘧疾感染過的人紅細(xì)胞)，與人體內(nèi)情況也不相同。因此，建立具有穩(wěn)定、高水平人紅細(xì)胞重建的造血免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型對(duì)人瘧疾感染的機(jī)制研究和新藥開發(fā)具有重要意義。

5 展 望

具有人紅細(xì)胞重建的人源化小鼠模型的開發(fā)對(duì)于人紅細(xì)胞相關(guān)疾病的研究具有重要意義，但其發(fā)展長(zhǎng)期遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于具有免疫系統(tǒng)重建的人源化小鼠模型[7]。經(jīng)過近些年的研究，已逐漸明確了人源化小鼠中人紅細(xì)胞缺陷的原因，初步實(shí)現(xiàn)了成熟人紅細(xì)胞在人源化小鼠模型中的重建[9,18]。然而，上述模型并未得到廣泛應(yīng)用，主要原因是小鼠巨噬細(xì)胞以補(bǔ)體C3非依賴方式排斥人紅細(xì)胞的機(jī)制仍不清楚，而克服小鼠巨噬細(xì)胞排斥所需注射的CLD-liposome對(duì)免疫缺陷小鼠具有較大毒性。因此，進(jìn)一步明確免疫缺陷小鼠巨噬細(xì)胞排斥人紅細(xì)胞的機(jī)制、有針對(duì)性地阻斷該排斥作用是建立具有長(zhǎng)期、穩(wěn)定水平人紅細(xì)胞重建的人源化小鼠模型的關(guān)鍵。隨著人紅細(xì)胞排斥機(jī)制研究的深入和特異性抑制人紅細(xì)胞排斥方法的出現(xiàn)，紅細(xì)胞人源化小鼠模型將被更多地應(yīng)用于人紅細(xì)胞相關(guān)疾病的研究中，促進(jìn)人紅細(xì)胞相關(guān)新型療法的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。