我院燒傷科臨床分離金黃色葡萄球菌特征及同源性探討

林時榮 ，宋秋月 ，羅東 ，李培群 ，鄒立津 ，陳開森

(南昌大學第一附屬醫(yī)院，1、急診科；2、南昌大學公共衛(wèi)生學院；3、檢驗科；4、燒傷科，南昌 330006)

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）（簡稱金葡菌）是醫(yī)院、社區(qū)及畜牧業(yè)重要的病原體，常易導致皮膚及軟組織感染，由于該菌可產生多種侵襲性酶類、毒力因子及形成耐多藥的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），故治療棘手[1-3]。由于該菌易在患者間傳播，而采用分子生物學分型方法對臨床分離菌株進行同源性分析可有效地監(jiān)測是否為感染傳播導致，從而為流行病學控制提供依據。南昌大學第一附屬醫(yī)院燒傷科為江西省重點學科，為區(qū)域性燒傷診治中心，雖然該病區(qū)的金葡菌感染率高，但這些分離菌株的特征、耐藥特性及同源關系被了解甚少。本研究將對我院燒傷科2015年分離的臨床金葡菌進行回顧性分析，了解菌株的特征及同源性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2015年1月至2015年12月我院燒傷科分離的非重復金葡菌67株，所有菌株用生物梅里埃公司VITEK-2 compact（法國）儀器鑒定。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC43300。

1.2 抗菌藥物 青霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、紅霉素、林可霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、萬古霉素、復方新諾明和呋喃妥因為儀器自帶，所有藥物測定均采用MIC法（梅里埃公司配套的GP67卡）。

1.3 主要試劑與儀器 哥倫比亞瓊脂粉購自英國Oxoid公司；革蘭陽性鑒定卡（GP卡）及配套藥敏卡（GP67）購于生物梅里埃公司；DNA marker、PCR MIX購于上海生物工程有限公司；細菌DNA提取試劑盒購于碧云天生物科技有限公司（江蘇海門）。PCR儀購自美國ABI公司；電泳儀購自北京六一公司；凝膠成像系統購自賽默飛時爾公司（美國）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 MRSA菌株表型檢測 根據2014年CLSI M100S（第24版）準則，篩選MRSA采用的是頭孢西丁MIC法，ATCC25923和ATCC43300為陰性和陽性質控菌株。

1.5 DNA模板提取 從純培養(yǎng)的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取過夜培養(yǎng)菌落8-10個到1ml無菌TE緩沖液中，加入20μl的溶菌酶（終濃度20mg/ml），充分混勻離心沉淀，37℃水浴 30min，最后采用CTAB法提取菌株DNA。

1.6 MecA基因篩查 擴增上下游引物，分別為：F：5’-GTGAAGATATACCAAGTGATT-3’；R：5’-ATG CGCTATAGATTGAAAGGAT-3’，產物大小 147bp。反應條件：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 30s共計30個循環(huán)，最后延伸7min。擴增產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定。

1.7 SCCmec分型 參照文獻設計引物[4]。反應條件：94℃預變性 10min；94 變性 30s，65℃退火 45s，72℃延伸 90s共計 30個循環(huán)，最后 72℃延伸7min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，從而確定MRSA的亞型。

1.8 毒力因子檢測 本研究測定的毒力基因包括殺白細胞素（PVL）、耐熱核酸酶（Nuc）和血漿凝固酶（Coa）共計3個。引物設計、反應條件等參照文獻[5-7]。具體相同Spa X區(qū)核苷酸序列的菌株則純化Nuc PCR產物及Coa PCR產物送上海生物工程有限公司雙向測序，產物拼接后采用MegAlign軟件分析，觀察核苷酸序列是否相同。

1.9 Spa基因檢測 PCR擴增Spa基因X區(qū)，上、下游引物序列分別為5’-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3’ 和 5’-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3’；反應條件：94℃預變性 5min；94 變性 30s，58℃退火45s，72℃延伸30s共計30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。擴增產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定，陽性結果純化后送上海生物工程有限公司雙向測序，測序結果經雙向拼接處理后，與數據庫（http：//www.ridom.de/spaserver/)中公布的堿基重復序列比較，從而確定菌株的spa型別。

1.10 Spa X區(qū)的同源性 將雙向拼接的序列采用Mega5.05軟件排列，根據X區(qū)5’端和3’的標志性序列進行雙向外源序列剪切，剩余序列采用N-J法進行聚類分析，從而了解各菌株間的遺傳關系。

1.11 Spa X區(qū)的穩(wěn)定性 隨機對5株燒傷科臨床分離金葡菌常規(guī)條件下培養(yǎng)，每24h傳代一次，共計20次。對原代菌及最后一次傳代菌的Spa X區(qū)PCR擴增（參照步驟1.5和1.9）并測序分析，觀察spa X區(qū)核苷酸序列的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 金葡菌分離率 燒傷科2015年共計分離金葡菌72株，除開重復分離菌株，共計分離到67株。其中創(chuàng)面?zhèn)诜置谖?4株，血流11株，痰及其它12株，根據當年燒傷科標本送檢標本總數為2761份，推斷出金葡菌檢出率為2.61%。

2.2 金葡菌耐藥情況 2015年共計分離到67株金葡菌，其中MRSA64株，MSSA3株。67株菌株對青霉素耐藥，四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥率分別為70.31%、74.63%和62.69%株；慶大霉素和利福平耐藥率為59.70%；環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星耐藥率分別為17.91%、14.92%和8.96%。11株菌對復方新諾明及3株菌對喹努普叮/達福普叮耐藥，未見萬古霉素和利奈唑胺耐藥株。

2.3 MecA基因檢測結果 67株菌中62株檢測到MecA基因，且表型篩查全部為陽性，兩者符合率為97.01%。

2.4 SCCmec分型結果 共計62株MecA菌中，Ⅰ型4株；Ⅱ型19株；Ⅲ型27株；Ⅳ型8株；Ⅴ型1株；3株未分出型別。

2.5 毒力因子檢測結果 67株菌中，PVL陽性12株，Nuc 67株，Coa 64株，其中MRSA的PVL陽性11株，MSSA的PVL陽性1株。

2.6 Spa分型結果 67株金葡菌共計含有10個基因型，以 t030為主，占總數的 31.34%（21/67）；t062 17株，占總數的25.37%；t002 10株，占總數的14.92%；t127 6株，其中包括t6418 4株；t037 3株；其它少見型別6株。

2.7 核苷酸多態(tài)性分析 首先應用Mega5.05軟件對67株金葡菌進行序列排列，剪除X區(qū)外的前后端測序不完全序列，采用N-J法進行聚類分析，聚類結果見圖2。67株菌共分成6個簇，其中簇1至簇 6分別有 29、8、10、2、7及 10株菌。 進一步觀察簇別和spa分型結果的關系，發(fā)現t030主要在C1、t127在C2、t002在 C3和 t062在C5中。

2.8 5株臨床菌株經20d20代傳代培養(yǎng)，測序比較前后序列，發(fā)現spaX區(qū)沒有任何SNP改變。

3 討論

本研究分離的67株菌中，頭孢西丁表型篩查檢測到64株MRSA，表明燒傷科MRSA檢出率高（95.52%，64/67），雖然mecA基因檢測是判斷菌株是否為MRSA的金標準，然而由于mecA基因存在異質性改變[8]，故通常不能僅以檢測到mecA基因來判斷是否為MRSA。本研究中，2株MRSA的頭孢西丁表型篩查為陽性，但沒檢測到mecA基因，是否為該原因值得探討。67株菌全對青霉素耐藥，表明所有分離菌株都產生了β-內酰胺酶，紅霉素、四環(huán)素、林可霉素、慶大霉素和利福平的耐藥率接近或超過60%，則這些藥物不能常規(guī)經驗性用于我院燒傷科患者的治療。三種代表性的氟喹諾酮類藥物耐藥率都低于20%，，故氟喹諾酮類藥可經驗性用于治療金葡菌的感染。復方新諾明和喹努普叮/達福普叮的耐藥率低，輕度感染時可考慮。嚴重性感染時，美國感染性疾病協會（IDSA）推薦使用萬古霉素和利奈唑胺治療[9]。

流行病學調查發(fā)現，MRSA亞型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共計分離到50株，約占總數的74.6%，表明燒傷科金葡菌感染株主要為醫(yī)院獲得性[10]。另外，本研究中共計9株MRSA菌為Ⅳ或Ⅴ型，且這些株菌都含有PVL基因，而該毒力因子常為社區(qū)獲得性感染菌株的標識之一，表明燒傷患者存在社區(qū)獲得性MRSA感染。

Spa測序分型研究發(fā)現，該院燒傷病區(qū)主要流行株為t030型，這與國內某些研究一致[11]。次要流行株為t062型，該型別菌常引起社區(qū)獲得性感染，最早于2003年在德國被發(fā)現，隨后該菌株在法國、比利時等西方國家被發(fā)現，近年來，該菌型在發(fā)現，例如浙江地區(qū)[12]。t002為全球彌散性播散菌株，目前從5大洲都被分離到，占總數的6.9%，本燒傷病區(qū)的分離率14.92%，高于全球平均水平。為了進一步了解分離菌株間的遺傳關系，我們選擇金葡菌A蛋白（spa）基因的X區(qū)進行單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）分析。研究結果表明：該基因區(qū)具有較好的位點穩(wěn)定性，與Frénay等的研究結果[12]一致。此外，部分菌株具有完全相同的序列，故在短時間內認為這些菌株具有流行病學聯系。例如6月中旬從燒傷ICU病區(qū)2d內分離的3株MRSA和4月初同一病區(qū)1株MRSA具有完全相同的X區(qū)序列，表明該型菌株導致了燒傷病區(qū)的院內感染。雖然有研究認為單采用X區(qū)進行重復序列的大小及數目多少的研究的分辨率甚至好于MLST和PFGE分型技術[13，14]。由于不具有流行病學聯系的菌株也可有相同的spa分型結果，故對于近期感染傳播不能單獨依靠spa分型結果來建立。本研究發(fā)現，即使具有相同spa型別的菌株由于存在基因堿基的點突變，即spaX區(qū)的分型結果相同，但聚類分析所獲得的SNP結果不同，這也從具有相同spa分型結果的菌株但并不屬于同一簇的結果也證明了這點。我們通過分析spaX區(qū)的序列，成功地建立了6組18人的院內感染聯系，具有感染聯系的患者不旦SCCmec和spa分型結果相同且Nuc和Coa的部分基因測序結果也完全相同，雖然部分患者并不來源于同一病房，是否這些患者是由于中間環(huán)節(jié)傳播而具有感染聯系，需要進一步研究。