非經(jīng)典微生物感染的病原學(xué)診斷及其耐藥性分析

趙 虎， 張景皓， 張艷梅

（復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海 200040）

隨著侵入性診療手段以及免疫抑制劑、激素和抗菌藥物等的大量應(yīng)用，非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）等非經(jīng)典微生物引起的感染日趨多見[1]。NTM引起的感染的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的感染的臨床表現(xiàn)非常相似，但治療方法截然不同。另外，由沙眼衣原體和支原體等非經(jīng)典微生物引起的人泌尿道感染的發(fā)病率也逐年增高[2]，嚴重危害患者的健康。為了解上海地區(qū)非經(jīng)典微生物的分布與感染、耐藥性狀況，本期“非經(jīng)典微生物感染的病原學(xué)診斷與藥物敏感性分析”專題匯集了非經(jīng)典微生物感染相關(guān)的1篇綜述、3篇專著和1篇病例報道，闡述了NTM、支原體和沙眼衣原體的實驗室診斷方法及其耐藥性分析結(jié)果，以期為臨床診療提供參考。

1 NTM的病原學(xué)診斷及耐藥性分析

NTM是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。根據(jù)NTM的生長速度可分為快速生長分枝桿菌（培養(yǎng)3～7 d，肉眼可見菌落）和緩慢生長分枝桿菌（培養(yǎng)7 d以上，肉眼可見菌落）[3]。快速生長分枝桿菌包括偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌，主要存在于自然環(huán)境中，可引起呼吸系統(tǒng)疾病，癥狀類似結(jié)核病。偶發(fā)分枝桿菌可引起人的局部感染或肺部感染，對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物均耐藥；龜分枝桿菌可導(dǎo)致免疫力低下的患者外傷后軟組織病變及手術(shù)后繼發(fā)感染，也可引起肺部感染；膿腫分枝桿菌常存在于自來水中，可引起醫(yī)院感染暴發(fā)，導(dǎo)致肺部感染的發(fā)病率和死亡率增加[3]，還可引起免疫力缺陷患者侵入性診療后的血流感染。劉淑芬等撰寫的病例報道《從血液中分離1株膿腫分枝桿菌的報道》詳細闡述了1例接受化療的胃癌晚期患者膿腫分枝桿菌血流感染的情況，其感染可能與免疫抑制相關(guān)。緩慢生長分枝桿菌可引起人類感染的菌種較多，最常見的有鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合菌組、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌和海分枝桿菌等，可引起肺部、淋巴結(jié)、皮膚及皮下軟組織病變，可引起免疫功能受損患者的傳染性疾病[5]。

隨著免疫缺陷性疾病和免疫抑制劑使用的增多，由NTM感染導(dǎo)致的疾病，尤其是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染或獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）合并NTM感染患者明顯增多[6]。我國1979—2010年的5次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，NTM分離率呈逐年上升的趨勢[7]。蔡金鳳等撰寫的論著《2012—2016年上海地區(qū)AIDS患者分枝桿菌分離及耐藥情況分析》報道了分離自1 940例AIDS患者4 648例臨床樣本的不重復(fù)分枝桿菌409株，包括199株MTB（48.66%）和210株NTM（51.34%），NTM在痰液中的分離率最高，其次是血液，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視。2002—2014年，我國臺灣地區(qū)疑似肺部分枝桿菌感染患者中，MTB的占比從82.50%下降至41.18%，而NTM占比從17.50%上升至58.82%[8]，反映出我國NTM感染呈上升趨勢。

NTM感染具有與結(jié)核病相似的臨床表現(xiàn)，但是治療、預(yù)防措施與結(jié)核病有明顯不同，不同的菌種對抗菌藥物的敏感性也不同，所以對分枝桿菌感染的菌種鑒定在流行病學(xué)調(diào)查及臨床診治方面均有重要意義。

目前常用的檢測方法中，抗酸染色鏡檢無法區(qū)分分枝桿菌種類，且敏感性弱，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。分枝桿菌培養(yǎng)是臨床診斷的金標準，也是目前確診的主要方法，但其檢測周期長，無法及時向臨床提供實驗室診斷結(jié)果。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）后直接測序、套氏PCR、限制性片段長度多態(tài)性PCR和多重分子信標探針芯片等分子生物學(xué)檢測技術(shù)，能快速、準確地鑒定菌種，并可直接對分枝桿菌核酸及耐藥基因多重靶點進行特異檢測，為分枝桿菌及其耐藥基因的鑒定及流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段[6]。

不同的NTM在治療前需遵循美國臨床實驗室標準化協(xié)會的標準進行藥物敏感性試驗。對于未經(jīng)治療的鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合菌組感染患者，推薦進行克拉霉素敏感性試驗。對未經(jīng)治療的堪薩斯分枝桿菌感染患者，首先進行克拉霉素和利福平藥物敏感性試驗，如有必要還可進行對阿米卡星、環(huán)丙沙星、乙胺丁醇、異煙肼、利奈唑胺、莫西沙星、利福布汀、鏈霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑的藥物敏感性試驗，異煙肼和鏈霉素對臨床治療有效但尚未建立敏感和耐藥的折點。不推薦進行海分枝桿菌分離株常規(guī)藥物敏感性試驗，在必要的情況下，可對阿米卡星、環(huán)丙沙星、克拉霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、乙胺丁醇、莫西沙星、利福平、利福布汀和復(fù)方磺胺甲噁唑進行藥物敏感性實驗。快速生長分枝桿菌常規(guī)藥物敏感性試驗應(yīng)包括阿米卡星、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、克拉霉素、多西環(huán)素、亞胺培南、利奈唑胺、美羅培南、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和妥布霉素（僅限于龜分枝桿菌）[9]。大量的研究結(jié)果表明不同地區(qū)的NTM耐藥率有顯著差異，治療前進行藥物敏感性試驗非常必要[10-11]。

2 支原體的病原學(xué)診斷及耐藥性分析

支原體是一群無細胞壁、能在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小的原核細胞微生物，共有6個屬，其中支原體屬和脲原體屬與人類疾病相關(guān)[5]。目前對人類致病的最常見的支原體有肺炎支原體、人型支原體和解脲脲原體。肺炎支原體主要通過呼吸道傳播，老年人和青少年易感，是引起社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體[11]。人型支原體和解脲脲原體可在大多數(shù)成人的下生殖道中分離到，可引起人體泌尿生殖系統(tǒng)的感染，是非衣原體、非淋球菌性尿道炎的主要病原體。除引起尿道炎外，人型支原體和解脲脲原體還可引起不孕不育癥、慢性前列腺炎、宮頸炎、盆腔炎等嚴重危害生殖健康的疾病[12]，宮內(nèi)感染后可通過垂直傳播引起危及新生兒生命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[13]。

目前，美國、英國等發(fā)達國家已經(jīng)逐步對25歲以上、有性生活者常規(guī)進行支原體、衣原體感染的篩查，我國也對備孕女性和孕產(chǎn)婦進行該病原體的常規(guī)檢測，為易感人群的預(yù)防和治療提供了病原學(xué)依據(jù)。

支原體培養(yǎng)是目前我國檢測支原體的主要手段，通常使用液體培養(yǎng)基直接檢測并同時進行支原體藥物敏感性試驗。但這種方法有時候會受到細菌或真菌的污染導(dǎo)致假陽性，因此需要固體培養(yǎng)基確認菌落形態(tài)才能最后作出診斷。培養(yǎng)法對樣本轉(zhuǎn)運的條件和時效性要求較高，在臨床應(yīng)用中會出現(xiàn)部分假陰性結(jié)果。實時熒光定量PCR和實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)等分子生物學(xué)方法與培養(yǎng)法比較敏感性和準確率大大提高，但無法同步為臨床提供藥物敏感性試驗結(jié)果[14-15]。

近年來，由于支原體引起的生殖道感染逐年增多，不規(guī)范治療和盲目用藥導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加，臨床療效逐漸減弱。目前，我國絕大多數(shù)臨床實驗室采用商品化試劑盒進行的藥物敏感性試驗只能將結(jié)果定性為敏感、中介和耐藥3種情況。美國臨床實驗室標準化協(xié)會推薦使用微量肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法進行支原體藥物敏感性試驗，目前僅有左氧氟沙星、莫西沙星、四環(huán)素、紅霉素、泰利霉素有參考折點[16]，其他抗菌藥物的藥物敏感性如何判斷，是一個急需解決的問題。另外，不同種類、不同地區(qū)支原體感染的藥物敏感性試驗結(jié)果也有顯著差異。周運恒等撰寫的《微量稀釋法檢測男性不育患者脲原體的耐藥性分析》分析了解脲脲原體對常用的12種抗菌藥物的藥物敏感性。其中多西環(huán)素、阿奇霉素、左氧氟沙星和莫西沙星的敏感率分別為96.9%、100%、29.7%和79.4%，提示左氧氟沙星可作為臨床經(jīng)驗用藥的首選。有研究結(jié)果表明，北京某地區(qū)解脲脲原體對多西環(huán)素、阿奇霉素和左氧氟沙星的敏感率分別為93.75%、89.58%、76.04%[17]，重慶部分地區(qū)對多西環(huán)素、阿奇霉素和左氧氟沙星的敏感率分別為98.5%、70.9%、14.6%[18]，表明不同地區(qū)支原體耐藥率有顯著差異，治療前進行藥物敏感性試驗很有必要。

3 沙眼衣原體的實驗診斷及耐藥性分析

沙眼衣原體是一類嚴格真核細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，需要通過宿主細胞繁殖。其在宿主細胞內(nèi)的生長繁殖周期有2個生物相：原體存在于細胞外，無繁殖能力，傳染性強，對抗菌藥物不敏感；始體存在于細胞內(nèi)，繁殖能力強，但無傳染性，對抗菌藥物敏感。沙眼衣原體引起的疾病可累及眼、生殖道、直腸等多個臟器，其引起的生殖道感染已成為最常見的性傳播疾病之一，常見于非淋菌性尿道炎、宮頸炎、輸卵管炎、附睪炎等，也可導(dǎo)致母嬰傳播。女性的上行感染可引起盆腔炎，導(dǎo)致不孕和異位妊娠[19]。由于沙眼衣原體感染是臨床常見的性傳播疾病，且感染者通常無癥狀，因此及時、準確的實驗室檢查可為感染者及時治療提供依據(jù)，防止再度傳播。

沙眼衣原體的實驗室檢測方法包括吉姆薩染色、碘染色和帕氏染色鏡檢，可發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體包涵體，但敏感性及特異性低，只適用于新生兒眼結(jié)膜刮片的檢查；細胞培養(yǎng)法的優(yōu)點為特異性幾乎為100%，但方法復(fù)雜，難以在臨床工作中廣泛應(yīng)用[20]；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗、直接免疫熒光法或免疫層析法檢測沙眼衣原體抗原是目前我國最常用的方法，但敏感性及特異性較低。顧偉鳴撰寫的綜述《沙眼衣原體免疫層析法應(yīng)用研究進展》詳細闡述了免疫層析法在沙眼衣原體實驗診斷中的應(yīng)用，提示泌尿生殖道沙眼衣原體免疫層析法檢測，尤其在高危人群中的檢測對防控衣原體感染蔓延有著重要的價值。但由于產(chǎn)品的原料和生產(chǎn)工藝等因素影響，不同品牌的沙眼衣原體免疫層析法檢測試劑的性能差異較大，應(yīng)合理選用。隨著生物醫(yī)藥技術(shù)革命性的進步，沙眼衣原體免疫層析法試劑盒的質(zhì)量有了較大的提高，泌尿生殖道沙眼衣原體免疫層析法檢測在各級醫(yī)院普遍被采用。沙眼衣原體核酸檢測方法是目前診斷沙眼衣原體感染敏感性和特異性最高的方法[21]。陳凱等撰寫的《7種國產(chǎn)沙眼衣原體核酸檢測試劑的平行比較》從檢測樣本濃度、樣本類型、質(zhì)控、敏感性和特異性等方面詳細分析了7種國產(chǎn)沙眼衣原體核酸檢測試劑的檢測性能，研究結(jié)果表明國產(chǎn)核酸試劑的特異性均超過95%，與美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準的沙眼衣原體核酸檢測試劑的特異性相當。但國產(chǎn)沙眼衣原體核酸檢測試劑中部分試劑的敏感性尚未達到90%，表明國產(chǎn)試劑應(yīng)在敏感性方面加大研發(fā)力度。

由于沙眼衣原體始體存在于細胞內(nèi)，所以選用的抗菌藥物應(yīng)具有良好的細胞穿透性；相關(guān)臨床用藥指南建議使用阿奇霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、氧氟沙星和左氧氟沙星等抗菌藥物[22]。鑒于細胞培養(yǎng)沙眼衣原體方法復(fù)雜，不能應(yīng)用于臨床，故無法進行常規(guī)藥物敏感性試驗。

4 總結(jié)與展望

隨著侵入性診療手段以及免疫抑制劑、激素和抗菌藥物等被大量使用，各種非經(jīng)典微生物感染所致疾病也逐年增多并嚴重危害患者的健康，應(yīng)引起臨床的高度重視。早期診斷和合理用藥是控制感染的關(guān)鍵。但目前NTM、支原體和沙眼衣原體等非經(jīng)典微生物產(chǎn)生的耐藥性已嚴重影響了臨床治療。本專題的5篇文章，從不同的角度分別闡述了非結(jié)核分枝桿菌、支原體和沙眼衣原體的病原學(xué)診斷方法以及耐藥性，為非經(jīng)典微生物感染的實驗室診斷及臨床治療提供了參考。

綜上所述，了解不同微生物的特點并研究其耐藥機制，有助于合理用藥，促進新藥研發(fā)，同時也可為臨床合理選用有效的藥物、迅速控制感染、減少耐藥性的產(chǎn)生提供重要依據(jù)。