應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

李金娟

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070）

中國是一個(gè)人口大國，也是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全是關(guān)系到國計(jì)民生和國家可持續(xù)發(fā)展的重大問題。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和加工逐漸向產(chǎn)業(yè)化和工業(yè)化發(fā)展，由此而引發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題不容忽視，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)的研究與發(fā)展顯得尤為重要。目前，我國已逐步建立起農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測網(wǎng)絡(luò)，極大地推動了我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。盡管如此，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全仍然是公眾及媒體熱切關(guān)心的話題，也面臨著極大的挑戰(zhàn)。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)是保障和監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要技術(shù)支撐，也是關(guān)鍵的制約因素。因此，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)提高及檢驗(yàn)檢測體系能力建設(shè)顯得更為迫切，將先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測，建立各種快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法，提高檢驗(yàn)檢測效率，有效保障農(nóng)產(chǎn)品從生產(chǎn)到進(jìn)入市場全過程安全，是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作提高和發(fā)展的必經(jīng)之路，也是夯實(shí)農(nóng)業(yè)質(zhì)量安全工作的基礎(chǔ)。

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)的檢測對象主要是針對影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的農(nóng)產(chǎn)品環(huán)境指標(biāo)（包括土地指標(biāo)、大氣指標(biāo)、水質(zhì)指標(biāo)等）中農(nóng)獸藥、重金屬等化學(xué)危害因子以及微生物、寄生蟲、生物毒素等生物危害因子[2]。然而，由于檢測對象種類繁多，組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，動態(tài)、痕量、濃度波動范圍大，并且樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾因子多，使得農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)研究具有復(fù)雜性[3]。傳統(tǒng)化學(xué)檢驗(yàn)檢測技術(shù)因具有費(fèi)工時(shí)、耗資大，常伴有試劑、溶媒污染，同時(shí)破壞對象物原有化學(xué)結(jié)構(gòu)等問題，已不能滿足于現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測控制發(fā)展的需求，而形態(tài)學(xué)觀察、生理生化、酶抑制法、免疫分析法和培養(yǎng)基篩選等檢測手段存在靈敏度低、假陽性、特異性差和效率低等明顯缺點(diǎn)。近年來，隨著生命科學(xué)與其交叉學(xué)科的發(fā)展，以及生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用，分子生物檢測技術(shù)作為一種基因水平的檢測技術(shù)，因其具有快速靈敏、特異性好、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全方面逐漸得以應(yīng)用，成為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全不可或缺的重要技術(shù)支撐。針對分子生物檢測技術(shù)的研究和發(fā)展成為新時(shí)期農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的戰(zhàn)略制高點(diǎn)之一，也備受農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域的關(guān)注與重視。

1 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)發(fā)展中存在的問題

1.1 農(nóng)獸藥殘留及農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)存在局限性 我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工作在檢測技術(shù)上存在著很大問題。近年來，我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)正在提升，根據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，我國農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)獸藥檢測技術(shù)水平已有極大的提高，農(nóng)獸藥殘留及多項(xiàng)藥物與添加劑等均可檢出，并且制定了確定的檢驗(yàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)。快速檢測技術(shù)也在市場中獲得了很大的成功，市場占比逐年提高。然而，盡管如此，我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工作在檢測技術(shù)上仍然存在很多問題。例如，農(nóng)獸藥殘留方面仍有許多種類無法進(jìn)行檢測；農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、內(nèi)源營養(yǎng)物及產(chǎn)地環(huán)境污染物質(zhì)無法進(jìn)行檢測；我國檢驗(yàn)檢測設(shè)備主要依靠進(jìn)口而缺乏自主研制研發(fā)的檢測儀器與設(shè)備，從而無法具有針對性的進(jìn)行檢測；現(xiàn)有快速檢測技術(shù)產(chǎn)品的靈敏性差，快檢儀器設(shè)備穩(wěn)定性低，存在著跟多問題等。

1.2 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估缺少檢測數(shù)據(jù) 我國對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作缺少風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)。就風(fēng)險(xiǎn)評估技術(shù)而言，我國對農(nóng)產(chǎn)品中存在的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了檢測，主要建立了階梯式的暴露評估和累積性的膳食暴露評估2種風(fēng)險(xiǎn)評估方式。然而，我國,農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不夠完善，毒理學(xué)、危害因素本底含量等方面的數(shù)據(jù)嚴(yán)重缺乏，無法滿足對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估的市場需求。真菌毒素對農(nóng)產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)評估便急需數(shù)據(jù)支撐。真菌毒素（Mycotoxin）是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，毒性非常高，對農(nóng)作物及其產(chǎn)品及飼料等植物源性產(chǎn)品都造成了污染，對人類和動物同樣有害。目前已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有200余種，可通過被其污染的谷物和飼料喂養(yǎng)的動物性產(chǎn)品（如奶、肉、蛋等）進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而成為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的危害因子危害人類健康。真菌毒素的共同毒性主要表現(xiàn)在可導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞毒性兩方面[4]。黃曲霉素、伏馬霉素、棕曲霉毒和玉米烯酮等許多真菌毒素一般在較低水平下的慢性毒性比其急性毒性更值得關(guān)注。究其原因在于某些真菌毒素確定有潛在致癌性，媒體對其進(jìn)行了廣發(fā)報(bào)道，但是因?yàn)槭称分姓婢舅氐耐耆コ遣豢赡艿?，所以?yīng)用快速可靠的毒素檢測技術(shù)將其控制在對健康不構(gòu)成威脅的安全水平內(nèi)就顯得尤為重要。然而，分子生物檢測技術(shù)作為一種快速可靠、靈敏性強(qiáng)的檢測技術(shù)因仍然停留在發(fā)展階段而尚未被納入風(fēng)險(xiǎn)評估的內(nèi)容中。因此，我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估工作缺少大量確實(shí)的數(shù)據(jù)，評估的樣板嚴(yán)重缺乏[5]。

1.3 農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境溯源方面缺乏技術(shù)提升 近些年，我國在產(chǎn)地溯源技術(shù)上取得了一定的成就，建立了穩(wěn)定的同位素法、DNA標(biāo)記法及近紅外反射光譜法等等多項(xiàng)產(chǎn)地溯源技術(shù)和方法。然而，我國現(xiàn)有的溯源體系僅限于產(chǎn)地信息記錄方面，缺乏與產(chǎn)品品質(zhì)、加工等相關(guān)的溯源技術(shù)，亟待形成完整的產(chǎn)地溯源體系。其中，重金屬作為一類有毒且難以降解并具有潛在危害性的農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境污染物而備受關(guān)注。重金屬污染具有隱蔽性、不可逆和長期性，在農(nóng)畜產(chǎn)品中均存在不同程度的殘留?，F(xiàn)已知具有很大毒性的重金屬至少20種，其經(jīng)食物鏈的生物放大作用侵入人體，長期積累則導(dǎo)致各種“公害病”乃至癌癥等，是影響人類健康的嚴(yán)重污染物質(zhì)。

1.4 農(nóng)產(chǎn)品加工過程中細(xì)菌污染與非法添加物檢測缺乏標(biāo)準(zhǔn)體系 我國是一個(gè)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與加工的大國，而農(nóng)產(chǎn)品加工過程中極易受有毒細(xì)菌等的污染，同時(shí)色素、防腐劑、保鮮劑等成分超量違規(guī)添加的現(xiàn)象在其生產(chǎn)、加工制作及流通的各個(gè)環(huán)節(jié)中普遍存在。國際上對于農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)都采用國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)或者較嚴(yán)格的國家（地區(qū)）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)。此標(biāo)準(zhǔn)體系的建立與實(shí)行對我國也顯得尤為重要。

2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 分子生物學(xué)檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用 目前，用于農(nóng)獸藥殘留的主要快速檢測技術(shù)為化學(xué)、免疫學(xué)及酶抑制技術(shù)。化學(xué)檢測技術(shù)主要用于有機(jī)磷的檢測，但是該方法僅限于土壤、果蔬中的有機(jī)磷檢測且靈敏度差。分子生物檢測技術(shù)（包括酶聯(lián)免疫技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、生物傳感器、基因差異顯示技術(shù)、生物芯片和基因探針等）以其高靈敏性和特異性而成為國內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究的熱點(diǎn)。作為分子生物檢測技術(shù)中發(fā)展最為迅猛的酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）和PCR技術(shù)已逐漸成為農(nóng)獸藥殘留檢測中最快速有效的主流檢測方法，也是色質(zhì)譜之外特異性最強(qiáng)的方法。

酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）是由分子免疫技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代測試手段而建立的一項(xiàng)微量檢測技術(shù)。因其靈敏性強(qiáng)，特異性好而成為農(nóng)獸藥殘留污染物檢測中應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)[6]。斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DOT-ELISA）、親和素生物素系統(tǒng)ELISA（ABC-ELISA）、雙夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DS-ELISA）等則是在其基礎(chǔ)上而衍生出來的檢測方法。由其研發(fā)制成的試劑盒在食品、蔬果和產(chǎn)地環(huán)境中已被大量應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留的測定分析，可檢測包括有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類在內(nèi)的大量農(nóng)藥，其中硫和磷含量的檢測靈敏性和特異性最佳。Singh[7]等應(yīng)用ELISA試劑盒對12個(gè)農(nóng)場區(qū)域的茄子樣品中的硫的含量進(jìn)行了測定，與氣相色譜法比較之后發(fā)現(xiàn)二者之間的相關(guān)性達(dá)到了0.98。除此之外，用抗體磁顆粒ELISA法對水中的西維因進(jìn)行檢測，測定范圍為0.22～0.25 μg/L，檢測結(jié)果與液相色譜法的檢測結(jié)果同樣表現(xiàn)出了極好的相關(guān)性。

2.2 分子生物檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素檢測中的應(yīng)用 目前，傳統(tǒng)的真菌毒素檢測方法基本都必須經(jīng)過前增菌、平板選擇性分離、生物化學(xué)和血清學(xué)分型鑒定4個(gè)步驟。整個(gè)檢測工作量大、周期長、成本高，且依靠主觀判斷，所以導(dǎo)致檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性低，靈敏性差。因此，作為現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)在真菌毒素檢測中的應(yīng)用則備受關(guān)注。目前，應(yīng)用于真菌毒素檢測的分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要包括有兩種方法，分別為包括酶聯(lián)免疫、免疫擴(kuò)散法、免疫傳感器法及免疫色譜法等在內(nèi)的免疫學(xué)方法，以及以核酸為研究基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，后者則主要有核酸探針法和PCR法。PCR法因其高靈敏性和特異性而更具優(yōu)勢，已成為真菌毒素檢測的優(yōu)勢技術(shù)。PCR（全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一種在體外模擬生物體細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程而對特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增的分子技術(shù)。其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)，是分子生物學(xué)領(lǐng)域的又一次革命性的突破，其發(fā)展與更新速度極快。隨著交叉學(xué)科的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)有了更多元化的發(fā)展，新的PCR檢測技術(shù)方法層出不窮。例如：PCR-基因掃描、等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)（Allele-specific PCR）、套式引物PCR技術(shù)、競爭PCR（C-PCR）技術(shù)和反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)等。

近些年，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的快速檢測。Babu等[8]建立了免疫磁珠捕獲Real Time PCR技術(shù)對黃曲霉毒素B1進(jìn)行了檢測，分別利用單克隆抗體直接夾心和多克隆抗體間接夾心免疫PCR檢測，結(jié)果表明單克隆抗體捕捉的直接夾心法是最佳方法，其檢測范圍 為 0.1～10 .0 μg/L，相關(guān)性為0.97，效能為 99.5%，這就為應(yīng)用免疫-PCR檢測農(nóng)產(chǎn)品中低分子抗原奠定了一定的基礎(chǔ)。He等[9]則建立了免疫-PCR技術(shù)用于檢測牛肉、牛奶及生雞蛋中的蓖麻毒素，結(jié)果表明牛肉、牛奶、生雞蛋的 檢測 限， 免 疫 -PCR技術(shù)分別為100、10、10 pg/mL，而 傳 統(tǒng) ELISA 法 分 別 為 103、103、104 pg/mL。Rajkovic等[10]對 含 1% 牛 血 清 蛋 白（BSA，Bovine Serum Albumin）的 磷 酸 鹽 緩 沖 液（PBS,phosphate buffer solution） 及 半 脫脂牛奶中的肉毒桿菌神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxins，Bo NT），A、B分別采用LISA和定量免疫-PCR法進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明Bo NT/A的檢測限用ELISA檢測分別為 15、30 ng/mL，檢 測均為 0.09 ng/mL；Bo NT/B 的檢測限用ELISA檢測分別為15、30 ng/mL，用定量免疫-PCR分別為 0.37、0.75 pg/mL。Leenalitha等[11]采 用 了 免 疫 -PCR 信號放大技術(shù)對牛奶、檸檬奶油派、金槍魚沙拉及火雞中的金黃色葡萄球菌腸毒素分別進(jìn)行了檢測，其檢測限均低至7.5 fg/mL。

2.3 分子生物檢測技術(shù)在產(chǎn)地環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品中殘留重金屬檢測中的應(yīng)用 目前實(shí)驗(yàn)室常用的重金屬檢驗(yàn)檢測方法主要有：石墨爐原子吸收光譜法，X射線熒光光譜法和ICP-AES等，雖然能準(zhǔn)確測量出樣品中單個(gè)金屬總量，但是耗時(shí)多，預(yù)處理過程復(fù)雜，測量結(jié)果無法反應(yīng)出重金屬氧化還原狀態(tài)的變化或其狀態(tài)演變的信息。進(jìn)而對重金屬污染普查和風(fēng)險(xiǎn)評估工作造成很大的不確定性。近些年，國內(nèi)外對重金屬快速檢測技術(shù)的研究很多，其中研究較為成熟且已應(yīng)用的有免疫學(xué)檢測技術(shù)、酶抑制法以及生物傳感器技術(shù)。免疫學(xué)檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于水質(zhì)樣品中銦(Ⅲ)、汞(Ⅱ)、鎘(Ⅱ)、鉛(Ⅱ)和鈾(Ⅵ)等的檢測。重金屬酶抑制法指的是利用脲酶抑制法對土壤和水質(zhì)樣品中的汞的測定，但也集中在環(huán)境中水樣及液體樣本的快速檢測。針對固體樣品中重金屬的快速檢測，目前研究并可應(yīng)用的則是生物傳感器技術(shù)。利用lac Z和ars D基因在大腸桿菌重組質(zhì)粒中的表達(dá)可制成具有高靈敏度的生物傳感器，可用于檢測重金屬亞銻，結(jié)果表明亞銻鹽的檢測限為 1×10-15mol/L?；诠夂舷到y(tǒng)Ⅱ的原理，利用重金屬殼模擬葉綠素分子中的Mg2＋反應(yīng)引起pH值變化的性質(zhì)，研發(fā)制成了生物傳感器，將藻細(xì)胞固定在瓊脂（濃度2%）中，由pH值測定值的變化來測定重金屬鉻和鎘的含量。

2.4 分子生物檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品加工過程檢測標(biāo)準(zhǔn)體系建立中的應(yīng)用 針對農(nóng)產(chǎn)品加工過程中有毒細(xì)菌污染的檢測同真菌毒素的污染檢測，分子生物學(xué)技術(shù)同樣可達(dá)到快速、特異性強(qiáng)、靈敏性高的檢測目的。農(nóng)產(chǎn)品加工過程中超標(biāo)、違規(guī)添加物品種繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但依其特性可歸類為農(nóng)獸藥殘留、化學(xué)藥物殘留、真菌毒素、重金屬污染等，根據(jù)上文所述，分子生物學(xué)技術(shù)仍然是較為理想的快速準(zhǔn)確的檢測方法。

3 展望

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全是關(guān)系到國計(jì)民生的大事，因此有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中的農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)分析、質(zhì)量控制和產(chǎn)地環(huán)境檢測都對檢測技術(shù)提出了更多更高的要求。近幾年，以ELISA法、PCR法、生物傳感器及免疫學(xué)檢測技術(shù)等為代表的分子生物學(xué)技術(shù)憑借其無可比擬的高靈敏性在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及農(nóng)業(yè)環(huán)境檢測中都得到了迅猛的發(fā)展，已獲得了國際范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注與研究，檢測速度、檢測范圍和檢測限都得到了極大的提升，且正在向便攜、高通量、具“類特異性”的方向發(fā)展，因此分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測已成為發(fā)展的趨勢。

雖然分子生物學(xué)檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測上具有廣闊的發(fā)展前景，但同時(shí)也存在著一定的局限性。例如，目前酶抑制法、免疫分析技術(shù)還在定性和半定量的發(fā)展階段，檢測室常規(guī)檢測中還未完全取代常規(guī)氣相色譜和高效液相色譜的方法；ELISA法雖然在農(nóng)獸藥檢測中高效、快速、靈敏，但由于其抗體制備較為困難、缺乏共用試劑且還不適于多項(xiàng)殘留的分析，所以未完全應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的檢測。因此，密切關(guān)注和了解國內(nèi)外最新研究發(fā)展動態(tài)，盡可能縮短最新技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用周期，把科學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。在檢測室現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合多種分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測，形成特異性強(qiáng)、靈敏性高、快速、便捷和高效的農(nóng)業(yè)質(zhì)量安全檢測體系將會是今后研究的重要發(fā)展趨勢。