外泌體在宮頸癌發(fā)病及診斷與治療中的研究進(jìn)展

崔世紅，呂曉峰，劉 靈，任琛琛，楊 立，程國梅，洪漢卿

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000)

宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性第2大常見惡性腫瘤，高危型人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是其主要危險因素[1]。近年來，宮頸癌的發(fā)病趨向于年輕化，嚴(yán)重影響婦女的健康。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程極其復(fù)雜，涉及到多種基因和多個連貫的病理過程[2]。及早發(fā)現(xiàn)和阻斷高危型HPV持續(xù)感染，在持續(xù)感染者中確定高危個體開展跟蹤隨訪，早期診斷癌前病變并進(jìn)行手術(shù)治療是防治宮頸癌的3個重要環(huán)節(jié)。當(dāng)前宮頸癌早期篩查技術(shù)主要有高危型人類乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)基因檢查和宮頸脫落細(xì)胞檢查。由于大多數(shù)婦女的HR-HPV感染為一過性，且持續(xù)性HR-HPV亞型感染患者中只有少數(shù)最終發(fā)展為宮頸癌，所以使得HR-HPV基因檢測篩查宮頸癌的敏感性高，特異性低。細(xì)胞學(xué)檢測篩查宮頸癌的特異性好，但受標(biāo)本采集手法和醫(yī)生診斷水平的影響較大，檢出率較低，重復(fù)性較差。同時，由于不能準(zhǔn)確甄別宮頸癌高危個體，無法對重點(diǎn)對象進(jìn)行緊盯防治，因此，經(jīng)常喪失干預(yù)的“最佳窗口期”?；谝陨弦蛩兀惹行枰獙ふ腋鼮槊舾械脑缙诤Y查標(biāo)志物和更具可行性的治療方法。外泌體是由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌的亞細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)，直徑30～100 nm，電鏡下呈杯狀或者球狀[3]。由于外泌體攜帶有其來源細(xì)胞的多種蛋白及核酸物質(zhì)，并且可以從外周血等體液中簡單獲得，這一現(xiàn)象提示可以通過外泌體所攜帶的分子來診斷和監(jiān)督控制腫瘤，作為診斷標(biāo)志物，外泌體呈現(xiàn)出較顯著的潛力[4-6]。本文就國內(nèi)外近年有關(guān)外泌體在宮頸癌中的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，為臨床宮頸癌的早期篩查及抗腫瘤藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 外泌體的生物學(xué)特征與功能

2013年，美國和德國3位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞內(nèi)的主要運(yùn)輸系統(tǒng)——囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)機(jī)制”榮獲諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎，將細(xì)胞外囊泡研究推向了新的高潮。外泌體作為細(xì)胞外囊泡的一種，最早可追溯到JOHNSTONE等[7]的研究，他們在對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行觀察時發(fā)現(xiàn)一種膜性囊泡小體，認(rèn)為它是細(xì)胞發(fā)展成熟階段排出的殘余“垃圾”，并將其命名為外泌體，但未對其進(jìn)行過多關(guān)注。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，除了網(wǎng)織紅細(xì)胞以外，體內(nèi)的朗格漢斯細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和多數(shù)腫瘤細(xì)胞均可以分泌這種囊泡小體[8]。此外，外泌體也可以通過離心的方式從人的腦脊液、血液、腹水等中分離出來[9-10]。在外泌體的組成成分中，一部分是所有外泌體共有的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜融合蛋白、磷脂、膽固醇、飽和脂肪酸、微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)等，另一部分是其來源細(xì)胞所特有的。外泌體存在雙面性[11]，其不但參與腫瘤的生成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等活動，還可以制約腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等，通過誘導(dǎo)作用強(qiáng)化相關(guān)免疫作用；這種功能作用的差異取決于外泌體的來源細(xì)胞。

研究顯示，相比于正常組織，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體更多，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫逃逸的調(diào)節(jié)，強(qiáng)化耐藥性[12-14]。對卵巢癌患者血漿外泌體的研究顯示，外泌體蛋白含量與卵巢癌分期之間呈正相關(guān)，通過監(jiān)測化學(xué)治療前后外泌體蛋白含量變化可以對患者的化學(xué)治療反應(yīng)性進(jìn)行預(yù)測[15]。腫瘤細(xì)胞可以分泌含有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等細(xì)胞因子的外泌體，這些外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面受體相結(jié)合，對血管產(chǎn)生刺激，繼而推動腫瘤生長。除此之外，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體還能對T細(xì)胞免疫功能進(jìn)行制約，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。與初始活化的T細(xì)胞共孵育之后，外泌體可以使分化抗原簇3、酪氨酸激酶3的表達(dá)下調(diào)，利用分化抗原簇95/分化抗原簇95配體信號通路，引起細(xì)胞凋亡[16]。LIS等[17]研究發(fā)現(xiàn)，惡性腹水中的外泌體可以使外周血T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，此項(xiàng)研究揭示了腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的全新機(jī)制。外泌體還能排出腫瘤細(xì)胞中的化學(xué)治療藥物，從而對化學(xué)治療藥物產(chǎn)生一定的耐藥性。比如，通過對順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體的分析，發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)含有順鉑，卵巢癌細(xì)胞可以利用釋放外泌體將抗腫瘤藥物排出腫瘤細(xì)胞[18]。除此之外，神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤微環(huán)境內(nèi)的外泌體可以對miRNA的轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)，繼而使腫瘤細(xì)胞的耐藥性更強(qiáng)。外泌體抑制劑GW4869可以使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞擁有更強(qiáng)的順鉑敏感性，這意味著外泌體抑制劑可用來緩解甚至克服神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的耐藥性。

2 外泌體與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展

相關(guān)研究證實(shí)，宮頸癌發(fā)病的關(guān)鍵初始環(huán)節(jié)為HR-HPV持續(xù)感染[19]，但宮頸癌的產(chǎn)生并非單因素導(dǎo)致的結(jié)果，而是多個因素共同影響的產(chǎn)物。HPV持續(xù)感染的宮頸上皮細(xì)胞(即癌前細(xì)胞)仍然保持著上皮源性特征，細(xì)胞之間存在廣泛的緊密連接。眾多因子在維持上皮源性特征及細(xì)胞緊密連接中發(fā)揮著重要作用。癌前細(xì)胞如何打破這種連接方式、啟動惡性轉(zhuǎn)變進(jìn)程，目前爭議頗多[20-21]。其中，上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化即上皮細(xì)胞經(jīng)過數(shù)個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換為間充質(zhì)細(xì)胞，從而失去細(xì)胞黏附，變得更易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，是HR-HPV持續(xù)感染轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌過程中的重要環(huán)節(jié)[22-23]。易紅艷等[24]研究顯示，將提取自宮頸癌細(xì)胞分泌的外泌體與癌前細(xì)胞Ect1共培養(yǎng)，誘發(fā)了癌前細(xì)胞Ectl向上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加速了向腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，說明外泌體中某些成分可以增加癌前細(xì)胞的體外侵襲能力，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。在外泌體包含的眾多物質(zhì)中，RNA是一類重要的腫瘤診斷生物標(biāo)志物分子，外泌體的包裹使其免受RNA酶的降解，進(jìn)而被轉(zhuǎn)移至相應(yīng)靶細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。已證實(shí)胰膽管癌、胃癌、卵巢癌患者的唾液或者血液中的外泌體內(nèi)的miRNA-4644、miRNA-1264、miRNA-141、miRNA200a等均高于正常人[25-27]，在宮頸癌患者的陰道灌洗液中同樣檢測出了高水平的miRNA-21和miRNA-146a[28]，因此，外泌體中上述幾種miRNA的含量可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，有望成為宮頸癌新的診斷標(biāo)志物。

研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的5 a生存率分別為64%和93%[29]，伴和不伴宮旁浸潤的宮頸癌患者的5 a生存率分別為31.8%和71.9%[30]，因此，如能早期發(fā)現(xiàn)微小的病灶和轉(zhuǎn)移，將極大地提高患者的生存率。外泌體被認(rèn)為是在腫瘤微環(huán)境中進(jìn)行腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間信息交流的“重要使者”。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中含有VEGF等小分子，可以誘導(dǎo)和加速腫瘤血管生成，營造一個適宜腫瘤形成的微環(huán)境[31-32]。如胰腺癌來源外泌體被肝巨噬細(xì)胞攝取后會分泌大量的轉(zhuǎn)化生長因子β，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成[33]。BARONI等[34]證實(shí)，卵巢癌來源的外泌體通過攜帶miRNA-9可以將正常的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，改造腫瘤微環(huán)境。外泌體在宮頸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中的研究尚在起步階段，相關(guān)研究還比較少。AROMSEREE等[35]通過對HPV相關(guān)的宮頸癌中外泌體傳遞的EB病毒編碼核糖核酸(Epstein-Barr virus-encoded RNA，EBER)信息進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)宮頸細(xì)胞或樹突細(xì)胞中高水平的EBER1可能通過刺激固有免疫進(jìn)而在宮頸上皮細(xì)胞從炎癥到腫瘤過渡過程中發(fā)揮作用。

3 外泌體與宮頸癌的診斷和治療

外泌體帶有來源細(xì)胞的特異性分子，可以呈現(xiàn)出來源細(xì)胞的特點(diǎn)。對腫瘤細(xì)胞外泌體的特異性分子進(jìn)行觀察和判斷，即可分清楚腫瘤的具體類型。除此之外，外泌體在血液、汗液等體液中廣泛存在，獲取難度較低，可通過體液得到，有利于后續(xù)的分離和鑒定。ZHANG等[36]用透射電鏡和實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測宮頸癌患者與正常者陰道灌洗液發(fā)現(xiàn)，宮頸癌來源的外泌體標(biāo)本中存在同源框轉(zhuǎn)錄反義RNA(homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1和母系表達(dá)基因3等3種長鏈非編碼RNA，且三者表達(dá)水平明顯高于正常人。外泌體來源的miRNA表達(dá)水平在宮頸癌診斷中也極具潛力。NAGAMITSU等[37]通過miRCURY LNA 微陣列對宮頸癌患者血清的miRNA(1 223個)的表達(dá)水平進(jìn)行了觀察和測試，并將之與正常組進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者中表達(dá)量超過正常組3倍的miRNA有6個；接著，通過qRT-PCR對宮頸癌(45例)、子宮頸上皮不典型增生(55例)和正常人(31例)的以上6種miRNA的具體表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，得知miRNA-483-5p、miRNA1246、miRNA1275、miRNA1290在各分組之間的表達(dá)差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以將其視為診斷宮頸癌的標(biāo)志物。

由于腫瘤細(xì)胞需要利用外泌體實(shí)現(xiàn)彼此的信息交換，而外泌體帶有一定的促存活因子，可以接受增殖信號，制約細(xì)胞的凋亡，誘發(fā)和引導(dǎo)血管新生，推動腫瘤進(jìn)一步增殖、生存及轉(zhuǎn)移，增加腫瘤治療的難度。對外泌體進(jìn)行阻隔或者清除可能是治療腫瘤的新渠道。MARLEAU等[38]研發(fā)了一種血液凈化裝置，主要可用于結(jié)合外泌體相關(guān)抗原，從而清除與腫瘤存在關(guān)聯(lián)的外泌體，其主要長處為不會發(fā)生藥物毒副作用，但目前尚無法確定該療法是否可以真正改善腫瘤患者的預(yù)后與生存期。此外，因?yàn)橥饷隗w的生成和分泌均是由機(jī)體自身完成的，并不會出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，且可以通過靶向定位至特定組織，因此，就腫瘤的靶向治療而言，外泌體的應(yīng)用前景十分廣泛[39-40]。但是，對利用外泌體研發(fā)的抗腫瘤藥物進(jìn)行推廣和普及，使其在腫瘤的臨床診治中發(fā)揮更多的作用，還需要對外泌體在腫瘤形成及發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行更多的研究。

4 展望

宮頸癌篩查雖然有HR-HPV基因檢查和宮頸脫落細(xì)胞檢查，但均有不足之處，對微小病灶的發(fā)現(xiàn)仍然有限。外泌體研究的持續(xù)加深，使我們更好地認(rèn)識和理解了腫瘤細(xì)胞間的相互作用與機(jī)制，使新的宮頸癌診治方式有了更有力的理論支撐。外泌體腫瘤來源的特異性和獲取方式簡單等特點(diǎn)，提示可以將外泌體作為腫瘤標(biāo)志物，構(gòu)建更為系統(tǒng)的宮頸癌早期篩查方式。此外，由于外泌體可以靶向定位至特定組織，可以借此開發(fā)出更有效的抗腫瘤靶向藥物等。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，利用血清外泌體基因測序進(jìn)行腫瘤早期無創(chuàng)診斷以及研發(fā)具備靶向功能的外泌體抗腫瘤藥物載體，是當(dāng)前最有可能被用于臨床治療的方向。

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