AKO62675在膀胱癌組織中的表達(dá)研究

胡少華,趙振理

(海南省婦幼保健院泌尿外科，海南?？?571199)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，相關(guān)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全球最常見的惡性腫瘤中，膀胱癌已躍居第11位，并且在男性患者中，其發(fā)病率升至第7位[1]。膀胱癌發(fā)病率較高，但其具體發(fā)生機(jī)制至今尚未完全明確。

基因組學(xué)等相關(guān)研究的深入使人們認(rèn)識(shí)到，膀胱癌的發(fā)生與基因突變及基因的異常表達(dá)相關(guān)。為了從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究，我們前期獲得1條變異程度較高的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)片段，并通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)擴(kuò)增獲得了其全長(zhǎng)序列。通過提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)獲得基因號(hào)：KR780251、蛋白號(hào)：AKO62675、并制備AKO62675抗體：Anti-KR。為了進(jìn)一步研究Anti-KR在膀胱癌中的表達(dá)情況，我們進(jìn)行了以下相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 試驗(yàn)中所用組織標(biāo)本均取自2014年至2016年山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科術(shù)后于病理科保存蠟塊。膀胱癌標(biāo)本40例，其中男性33例，年齡44～84歲，平均63.79歲；女性7例，年齡34～81歲，平均58.57歲。腺性膀胱炎標(biāo)本15例，其中男性5例，年齡23～72歲，平均50.20歲；女性10例，年齡31～74歲，平均56.70歲。從調(diào)取的膀胱癌和腺性膀胱炎存檔蠟塊標(biāo)本中選取邊緣含有的正常膀胱組織共23例作對(duì)照，其中男性15例，年齡23～84歲，平均57.67歲；女性8例，年齡50～72歲，平均57.63歲。

1.2 主要試劑及儀器 AKO62675抗體：Anti-KR(由上海吉爾生化有限公司協(xié)助制備)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品)。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 利用切片機(jī)切取厚度為4.0 μm的切片，將其置于70 ℃烤箱內(nèi)烘烤30 min。二甲苯及乙醇梯度脫蠟水化后，于高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，然后采用3%H2O2消除內(nèi)源性的過氧化物酶。分別加入按1∶200稀釋的Anti-KR多克隆抗體，37℃恒溫箱中孵育2 h，再加入酶標(biāo)二抗于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。以已知的陰性結(jié)果作陰性對(duì)照，以已知的陽性結(jié)果作陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 Anti-KR的顯色部位主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色至棕黃色，根據(jù)顯色強(qiáng)度分為：細(xì)胞質(zhì)不著色(-)、細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色顆粒(+)、細(xì)胞質(zhì)顯色介于淺黃色與棕黃色之間(++)、細(xì)胞質(zhì)顯色呈棕黃色顆粒(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Anti-KR的染色情況采用秩和檢驗(yàn)，利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

膀胱腫瘤組織Anti-KR染色結(jié)果呈+、++、+++(圖1)，可見細(xì)胞質(zhì)均有染色。腺性膀胱炎組織Anti-KR染色結(jié)果呈+、++，正常膀胱組織Anti-KR染色呈陰性、+(圖2)。Anti-KR染色在膀胱腫瘤組織、腺性膀胱炎組織與正常膀胱組織中的情況見表1。

圖1 Anti-KR在膀胱腫瘤組織中的染色情況(×100)

A：輕度染色； B：中度染色；C：重度染色。

圖2 Anti-KR在腺性膀胱炎組織及正常膀胱組織中的染色情況(×100)

表1 Anti-KR染色在各組織中的情況 (例)

采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析：Anti-KR染色在膀胱腫瘤組織與正常膀胱組織、膀胱腫瘤組織與腺性膀胱炎組織、腺性膀胱炎組織與正常膀胱組織間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

作為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，膀胱癌的發(fā)病率逐年增高[2]。盡管膀胱癌得到了越來越多的關(guān)注，但其具體發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全清楚。從基因水平的研究發(fā)現(xiàn)膀胱的發(fā)生與基因突變及基因的異常表達(dá)相關(guān)。為了從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)一步研究，則需要對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行分離、克隆及序列分析。

我們前期通過DIATCHENKO等[3]建立的抑制消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)對(duì)膀胱癌組織與正常膀胱組織進(jìn)行研究，獲得1條具有較大特異性的片段，其變異程度較高，網(wǎng)上比對(duì)后發(fā)現(xiàn)為1條類似表達(dá)CK20基因的片段。CK20又叫細(xì)胞角蛋白20，屬于細(xì)胞角蛋白家族，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CK20在膀胱癌組織中具有較高的表達(dá)，而在正常膀胱組織中幾乎無表達(dá)，并且與膀胱癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切的相關(guān)性[4-6]。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)該片段染色體位置和CK20不同，序列與STRAUSBERG等[7]發(fā)現(xiàn)的序列具有高度相似性，但他們未對(duì)該序列進(jìn)一步研究，BROWER[8]及其團(tuán)隊(duì)在小鼠中發(fā)現(xiàn)該序列，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該片段基因位于端粒的近端區(qū)域，該區(qū)域易導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性。由于他們并未對(duì)該序列在膀胱癌中的作用進(jìn)行分析，而我們?cè)诎螂装┙M織中發(fā)現(xiàn)了該序列，因此向NCBI提交申請(qǐng)并成功獲得基因號(hào)：KR780251、蛋白號(hào)：AKO62675。為了進(jìn)一步對(duì)AKO62675的功能及表達(dá)情況進(jìn)行研究，我們通過對(duì)比分析KR780251的ORF所翻譯的氨基酸多肽與CK20的差異，以差異性較大的氨基酸序列為模板進(jìn)行寡肽的合成，并以此進(jìn)行多克隆抗體的制備，成功地制備出符合要求的多克隆抗體：Anti-KR。

腺性膀胱炎是膀胱黏膜上皮的良性增生性反應(yīng)，但卻具有潛在的惡變傾向，臨床上大多數(shù)腺性膀胱炎進(jìn)展發(fā)生癌變后為膀胱腺癌，極少數(shù)會(huì)癌變后病理類型為尿路上皮癌。為了進(jìn)一步對(duì)多克隆抗體進(jìn)行研究，在選取標(biāo)本同時(shí)選取部分普通腺性膀胱炎組織標(biāo)本觀察抗體表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)膀胱癌組織、腺性膀胱炎組織及正常膀胱組織進(jìn)行免疫組化染色。膀胱癌組織和腺性膀胱炎組織染色均為陽性，并且膀胱癌組織染色明顯比腺性膀胱炎組織染色深，正常膀胱組織大部分染色呈陰性，部分標(biāo)本(8/23)可見陽性染色，其陽性染色率為34.78%。腺性膀胱炎組織標(biāo)本均可見陽性染色，且少部分染色(7/15)比正常膀胱組織染色深。膀胱癌組織均可見陽性染色，且大部分染色(36/40)較腺性膀胱炎的組織染色深。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，此抗體在膀胱癌組織和正常膀胱組織間、在膀胱癌組織與腺性膀胱炎組織間、在腺性膀胱炎與正常膀胱組織間，其染色均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗體染色從正常膀胱組織到腺性膀胱炎組織以及膀胱癌組織具有從陰性到陽性染色并且染色逐漸加深的趨勢(shì)，提示AKO62675與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能具有重要的相關(guān)性，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。

[1] FERLY J，SOERIOMATARAM I，DIKSHIT R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer，2015,136(5):e359-386.

[2] CHEN W，ZHENG R，BAADE PD，et al. Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[3] DIATCHENKO L,LAU YF,CAMPBELL AP,et al.Suppression subtractive hybridization：a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA.1996,93(12):6025-6030.

[4] GIL DA COSTA RM，OLIVEIRA PA，VASCONCELOS-N?BREGA C et al. Altered expression of CKs 14/20 is an early event in a rat model of multistep bladder carcinogenesis[J].Int J Exp Pathol,2015,96(5):319-325.

[5] GHAINI MH,ESMAILNEJAD SS,DAVATI A. Cytokeratin 20 in transitional cell carcinoma of bladder and its relation with prognosticfactors[J].IJP,2012,7(3):145-150.

[6] SCHMIDT J，PROPPING C，SIOW WY，et al. Diagnostic and prognostic value of bladder cancer-related transcript markers in urine[J].J Cancer Res Clin Oncol,2016,142(2):401-414.

[7] STRAUSBERG RL，F(xiàn)EINGOLD EA，GROUSE LH，et al. Generation and initial analysis of more than 15000 full-length human and mouse cDNA sequences[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(26):16899-16903.

[8] BROWER CS，ROSEN CE，JONES RH，et al. Liat1，an arginyltransferase-binding protein whose evolution among primates involved changes in the numbers of its 10-residue repeats[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(46):e4936-4945.