南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池亞硝酸鹽去除菌分離鑒定及去除率影響因素分析

吳 越，許凱倫，黃振華，陸榮茂，姚青怡

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325000； 2.寧波大學(xué)，浙江 寧波 315000)

南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)是我國主養(yǎng)對(duì)蝦品種，其養(yǎng)殖面積及養(yǎng)殖產(chǎn)量在國內(nèi)均占居主導(dǎo)地位。隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，工廠化養(yǎng)殖模式快速興起，其中高位池精養(yǎng)模式由于其高密度、高產(chǎn)量、高效益的特點(diǎn)備受推崇。但在高位精養(yǎng)中由于過量投喂配合飼料、高密度對(duì)蝦自身代謝終產(chǎn)物積累以及藻相的異常變化等因素往往容易引起水質(zhì)敗壞，而亞硝酸鹽含量居高不下是養(yǎng)殖過程中經(jīng)常碰到的棘手問題之一。亞硝酸鹽是氨轉(zhuǎn)化成硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物，是養(yǎng)殖水體中主要的污染物之一。甲殼類動(dòng)物對(duì)亞硝酸鹽毒性更為敏感，亞硝酸鹽脅迫會(huì)引起蝦體組織病變，抗病有關(guān)酶活力顯著下降，抗病能力減弱，嚴(yán)重影響對(duì)蝦的健康生長(zhǎng)并制約著養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高[1-3]。控制水體中亞硝酸鹽污染已成為集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖成功的關(guān)鍵措施之一。在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中積累了一些物理和化學(xué)方法去除亞硝酸鹽，如物理吸附法、還原法、氧化法和間接控制法等，但這些方法往往只能暫時(shí)緩解和控制亞硝酸鹽含量高的情況，其作用時(shí)間短且亞硝酸鹽濃度易反彈，不適于規(guī)?；?、高密度養(yǎng)殖模式[4]。近年來，使用微生態(tài)制劑調(diào)控水質(zhì)作為一種綠色環(huán)保的養(yǎng)殖環(huán)境生物治理方法受到廣泛關(guān)注[5]。微生態(tài)制劑防治亞硝酸鹽污染中最為重要的是選擇合適高效的降解菌株。不同來源的菌種適應(yīng)性不同，有益微生物制劑在不同地區(qū)的效果也不同[6]。目前已經(jīng)開展了一些關(guān)于亞硝酸鹽去除菌的篩選工作，但對(duì)適用于南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池的亞硝酸鹽去除菌的研究仍然較少。本研究以南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖后期的自然水體為材料，通過菌株富集、分離、純化、鑒定和環(huán)境因子單因素試驗(yàn)，旨在尋找適用于高位精養(yǎng)池模式的亞硝酸鹽高效降解菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

用于分離細(xì)菌的水樣于2016 年 7 月16日取自位于浙江省溫州市龍灣區(qū)的浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所永興基地南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池。用采水器在水深約50 cm 處采集水樣，樣品立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于后繼試驗(yàn)。試驗(yàn)中使用的自然海水也來自永興基地，配置培養(yǎng)基的試劑購買自溫州市鹿城金山化學(xué)試劑儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分離和純化

首先對(duì)采集的水樣進(jìn)行富集處理。本研究的富集培養(yǎng)基參考并改進(jìn)侯穎等[7]報(bào)道富集培養(yǎng)基制備，具體成分為葡萄糖5.0 g，NaNO21.0 g，(NH4)2SO42.0 g， KNO31.0 g，抽濾自然海水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5。121 ℃下高壓蒸汽滅菌 15 min 后用于去除亞硝酸鹽菌株的富集。

為富集亞硝酸鹽去除菌株，取采集水樣10 mL加入到100 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)基中再加入10 mL新鮮富集培養(yǎng)基強(qiáng)化富集效果。如此強(qiáng)化富集3次以淘汰對(duì)亞硝酸鹽耐受性差的菌株。隨后取10-1、10-2、10-3、10-4和10-5等5個(gè)稀釋度的富集培養(yǎng)液各100 μL 分別涂布到分離培養(yǎng)基上(分離培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加1.5%的瓊脂制成)，30 ℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出明顯菌落。選取形態(tài)、顏色不同的單個(gè)菌落在分離培養(yǎng)基上多次畫線分離，直至無雜菌出現(xiàn)。最后將篩選出的純化菌株在斜面2216E瓊脂培養(yǎng)基上畫線保種。

1.2.2 菌種的篩選

將上述分離得到的菌株接種到 2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng) 24 h，以1∶50的比例接種至滅菌的篩選培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 48 h。篩選培養(yǎng)基參考郭靜等[8]報(bào)道，具體成分葡萄糖1.0 g，NaNO327.5 mg，(NH4)2SO46.25 mg，KNO33.0 mg，抽濾養(yǎng)殖海水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5，篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量約2 mg·L-1。48 h后培養(yǎng)基用0.22 μm針式濾器過濾，用Seal AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定接種培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量，以未接種菌液培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度為對(duì)照，每個(gè)菌株篩選培養(yǎng)重復(fù)3次，計(jì)算平均值用于比較各菌株的亞硝酸鹽去除率。

亞硝酸鹽去除率=(未接種篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度-接種菌篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度)/未接種菌篩選培養(yǎng)基亞硝酸鹽濃度×100。

1.2.3 篩選菌株的鑒定

篩選菌株的種類鑒定綜合采用形態(tài)學(xué)特征、16S rRNA測(cè)序及生理生化相關(guān)特征3個(gè)方面進(jìn)行。

菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察。將篩選菌株涂布到2216E瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行革蘭氏染色并觀察菌落形狀、顏色、透明度等特征。

16S rRNA測(cè)序。培養(yǎng)后菌液基因組DNA采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提。DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

菌株生化特征鑒定。菌株的生理生化特征檢測(cè)方法通過檢索《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]進(jìn)行。本研究用于生理生化特征檢測(cè)的指標(biāo)見表1。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)測(cè)定

采用光電比濁法測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線[11]。將菌株按1∶50接種至50 mL 2216E液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)，分別在 0、6、12、24、48和72 h 取樣3 mL，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下菌液的吸光度值(D600 nm)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 環(huán)境因子對(duì)菌株亞硝酸鹽去除能力影響

本研究設(shè)置的pH值梯度為7.0、7.5、8.0、8.5(溫度為30 ℃，鹽度為2.5%)；鹽度梯度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%(溫度為30 ℃，pH值為7.5)；溫度梯度為20、25、30、35 ℃(pH值為7.5，鹽度為2.5%)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液以1∶50接種到篩選培養(yǎng)基中，除用于比較的單一因子不同外，其他培養(yǎng)條件均保持一致。所有試驗(yàn)處理均培養(yǎng)48 h 后取樣過濾，測(cè)定培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度，分別計(jì)算菌株在不同溫度、鹽度和pH值培養(yǎng)條件下亞硝酸鹽去除率。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行。數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS進(jìn)行計(jì)算、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及篩選

對(duì)蝦養(yǎng)殖塘水體經(jīng)過富集和分離共得到56株細(xì)菌。經(jīng)過篩選培養(yǎng)測(cè)定亞硝酸鹽去除率獲得3株可去除亞硝酸鹽的菌株，分別編號(hào)為N3、N29和N38，其中N29去除率最高，達(dá)到90%以上，因此選擇N29做后續(xù)的研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 細(xì)菌16S rRNA序列

將N29的16S rRNA測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，N29的16S rRNA的序列和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)、空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等有99% 的相似性(圖1)。16S rRNA 基因序列分析可以確定該菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，但無法確定具體是何種芽孢桿菌。

圖1 N29菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 細(xì)菌生化特征

N29在2216E培養(yǎng)基上為白色不透明、扁平、邊緣不光滑菌落，革蘭氏染色結(jié)果顯示為陽性菌。共進(jìn)行14項(xiàng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)，其中12項(xiàng)為陽性，2項(xiàng)為陰性，鑒定結(jié)果表明其生理生化特征與芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌相符(表1)。

表1 N29菌株的生理生化特征

2.3 菌株生長(zhǎng)

采用光電比濁法繪制了菌株N29的部分生長(zhǎng)曲線，包括延滯期、指數(shù)期和平穩(wěn)期(圖2)。結(jié)果顯示，N29菌株在培養(yǎng)初期6 h內(nèi)生長(zhǎng)較緩慢為延滯期，之后菌液濃度開始急速上升，可視為進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。至36 h為止N29菌株一直處于快速生長(zhǎng)階段，之后生長(zhǎng)速度減慢，開始進(jìn)入平穩(wěn)期。N29菌株的生長(zhǎng)曲線基本呈現(xiàn)“S”型，與細(xì)菌的典型生長(zhǎng)曲線相似。

圖2 N29菌株的生長(zhǎng)曲線

2.4 菌株去除亞硝酸鹽能力

pH值梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h后，在pH值為7.0～7.5時(shí)亞硝酸鹽去除率受pH值的影響較小，當(dāng)pH值繼續(xù)上升時(shí)，其去除亞硝酸鹽能力呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，在pH值為7.5時(shí)，亞硝酸鹽去除率最高為59.9%(圖3)。菌株N29在培養(yǎng)48 h后，亞硝酸鹽去除能力隨著pH值呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在pH值為7.5時(shí)最高達(dá)96.4%，顯著高于pH值為7.0和8.5時(shí)去除率，但與pH值為8.0時(shí)差異不顯著。pH值梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，N29去除亞硝酸鹽適宜pH值為7.5，但在pH值7.0～8.5其去除率均能達(dá)到90%以上。

圖3 pH值對(duì)亞硝酸鹽去除能力的影響

鹽度梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h，其亞硝酸鹽去除率先隨著鹽度的上升而提高，至鹽度為2.5%時(shí)其去除率達(dá)到最高為66.0%，但與鹽度為2.0%時(shí)差異不明顯。隨著鹽度的進(jìn)一步升高，N29亞硝酸鹽去除率下降，在鹽度為3.0%和3.5%時(shí)其去除能力均顯著低于鹽度2.5%時(shí)。培養(yǎng)48 h后N29在鹽度為2.5%時(shí)去除率最高為94.4%，各鹽度梯度下差異不明顯，去除率總體均維持在93%左右(圖4)。

圖4 鹽度對(duì)亞硝酸鹽去除能力的影響

溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株N29培養(yǎng)24 h，其亞硝酸鹽去除率先隨著溫度的上升而提高，至溫度為35 ℃時(shí)其去除率達(dá)到最高為58.3%，顯著高于20 ℃和25 ℃時(shí)的去除率。但與30 ℃時(shí)去除率十分接近。培養(yǎng)48 h后N29亞硝酸鹽去除率的變化趨勢(shì)與24 h時(shí)相似，也是先隨著溫度的上升而顯著升高，至30 ℃時(shí)達(dá)到最高為92.9%，35 ℃時(shí)略有下降但與30 ℃時(shí)差異不顯著(圖5)。結(jié)果表明，溫度對(duì)N29亞硝酸鹽降解率的影響較大，適宜的溫度為30～35 ℃。

圖5 溫度對(duì)亞硝酸鹽去除能力的影響

3 小結(jié)與討論

本研究通過富集培養(yǎng)和分離純化從南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖后期水體中篩選到一株高效去除亞硝酸鹽的菌株。高位精養(yǎng)池在養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖動(dòng)物體重增加，池塘承載量明顯加大，且養(yǎng)殖水體中大量的殘餌、動(dòng)物排泄物和死亡殘?bào)w積累，水質(zhì)情況很容易惡化，亞硝酸鹽濃度急劇升高，因此采取有效的水質(zhì)調(diào)控措施尤為重要。在高濃度亞硝酸鹽的后期養(yǎng)殖水體中可能天然存在對(duì)亞硝酸鹽有較好的耐受性和較高去除率的菌株，直接從自然條件下的養(yǎng)殖水體中篩選去除亞硝酸鹽的菌株是尋找適合臨床應(yīng)用菌株的捷徑。經(jīng)該方法獲取的菌株是水體中正常菌群成員之一，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和較小的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究中篩選到的南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池亞硝酸鹽去除菌經(jīng)16S rRNA測(cè)序和生理生化檢測(cè)鑒定為地衣芽孢桿菌。芽孢桿菌能分泌豐富的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等高活性酶類，可分解養(yǎng)殖環(huán)境中碳系、氮系、磷系、硫系污染物和復(fù)雜多糖、蛋白質(zhì)和水溶性有機(jī)物，從而降低水體富營養(yǎng)化并減少底泥生成，且在其生長(zhǎng)繁殖過程中會(huì)分泌一些細(xì)菌素等物質(zhì)，對(duì)養(yǎng)殖水體中的異養(yǎng)細(xì)菌、弧菌等致病菌的生長(zhǎng)和繁殖具有一定的抑制作用[12]。芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的水質(zhì)改良益生菌，但目前在水質(zhì)的凈化作用方面研究較多的主要還是枯草芽孢桿菌[13-15]。對(duì)于地衣芽孢桿菌在水質(zhì)亞硝酸鹽凈化中的作用，曹煜成等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌可顯著降低黃鰭鯛(Acanthopagruslatus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)等養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽的含量，使水質(zhì)得到顯著改善。白小麗等[18]采用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合制劑對(duì)鱖(Sinipercachuatsi)及餌料魚池塘進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮的最大降解率可達(dá)77.5%。本研究中篩選到N29菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率可達(dá)到90%以上，表明N29有較高的去除亞硝酸鹽能力，可以用于開發(fā)新型的高效水質(zhì)凈化微生物態(tài)制劑。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體的理化因子一直處于不斷變化中，而微生物的水質(zhì)凈化能力會(huì)受理化因子波動(dòng)的影響。李炎生等[19]從活性污泥中分離篩選到一株異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)菌株硝化作用最強(qiáng), 溫度高于或低于此溫度都不利于菌株其硝化作用的進(jìn)行，另外適度的鹽濃度(1 g·L-1)對(duì)硝化細(xì)菌氧化亞硝酸鹽具有一定的促進(jìn)作用, 但是鹽濃度過高反過來又會(huì)抑制硝化反應(yīng)的進(jìn)行。熊焰等[20]從養(yǎng)殖水體中篩選到一株降解亞硝酸鹽的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，研究發(fā)現(xiàn)pH值為5.5～7.0 時(shí)，菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率隨pH值的升高而上升；pH 值為7.0～8.5時(shí)，菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率隨pH值的升高而降低，pH值為7.0 時(shí)降解率最高達(dá)80.2%；溫度從18 ℃到33 ℃過程中，菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率逐步升高，從33 ℃到50 ℃時(shí)降解率呈下降趨勢(shì)，在28～33 ℃, 菌株的降解率較高平均達(dá)88.9%。本研究單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：pH值在7.0～8.5時(shí)N29去除亞硝酸鹽能力隨pH值升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，其中pH值為7.5時(shí)去除率最高，且在pH值為7.0～8.0均可以達(dá)90%以上；鹽度在2.0%～3.5%時(shí)N29亞硝酸鹽去除率沒有顯著差異，說明其有較廣適鹽性；溫度對(duì)N29亞硝酸鹽去除率有較明顯的影響，其亞硝酸鹽去除率先隨著溫度的上升顯著提高，至溫度為30～35 ℃時(shí)其去除率最高。溫度對(duì)菌株去除亞硝酸鹽有顯著影響，這可能一方面是由于溫度會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)增殖及代謝活動(dòng)，另一方面是因?yàn)橄趸饔眠^程本身包含了一系列的酶促反應(yīng)，其反應(yīng)速率也受溫度影響?？傮w而言，N29去除亞硝酸鹽的適宜pH值為7.5～8，鹽度為2.0%～3.5%，適宜的溫度為30～35 ℃，具有較廣的pH值和鹽度適應(yīng)范圍，比較適合用于夏季南美白對(duì)蝦高位精養(yǎng)池養(yǎng)殖模式下水質(zhì)亞硝酸鹽的調(diào)節(jié)，但是關(guān)于其在生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中實(shí)際水質(zhì)調(diào)控效果還需后續(xù)進(jìn)一步研究。

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