瓦氏雅羅魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

李 博 何亞鵬 劉 寧

瓦氏雅羅魚(yú)，又被稱為華子魚(yú)、白魚(yú)，是鯉科、雅羅魚(yú)亞科、雅羅魚(yú)屬的代表魚(yú)類。瓦氏雅羅魚(yú)最適宜的水質(zhì)為弱堿性，水溶氧量應(yīng)高于5 mg/L，透明度在30 cm左右。在這樣的水域中，瓦氏雅羅魚(yú)能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)[1]。由于捕撈強(qiáng)度的增加、生態(tài)環(huán)境的變遷以及疫病的影響，瓦氏雅羅魚(yú)的數(shù)量逐漸減少，瓦氏雅羅魚(yú)作為北京土著魚(yú)類，是北京市二級(jí)保護(hù)魚(yú)類，其資源現(xiàn)狀堪憂。

殺鮭氣單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，隸屬于氣單胞菌屬氣單胞菌科。該菌在全球范圍內(nèi)分布廣泛，可引起鮭魚(yú)科魚(yú)類的“癤瘡病”和“敗血癥”，典型臨床癥狀為魚(yú)體表面多處潰爛。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌也可感染其他魚(yú)類，如鯉科魚(yú)類，該菌還可與其他細(xì)菌混合感染，對(duì)鮭魚(yú)科和鯉科魚(yú)類危害很大[2]。本試驗(yàn)從北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心馴養(yǎng)車(chē)間患病的瓦氏雅羅魚(yú)體內(nèi)分離純化出1株殺鮭氣單胞菌，然后對(duì)其進(jìn)行了理化特性、分子生物學(xué)特性及耐藥性分析，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥，有效地對(duì)瓦氏雅羅魚(yú)進(jìn)行了救護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料 患病的瓦氏雅羅魚(yú)來(lái)源于北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心馴養(yǎng)車(chē)間。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定試劑和藥敏紙片均購(gòu)自北京賽為思生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，細(xì)菌DNA提取試劑盒（DP302）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離 取患病的瓦氏雅羅魚(yú)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)采集內(nèi)臟，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，觀察形成的菌落的形態(tài)、顏色和大小等。將分離菌進(jìn)行革蘭染色，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2 生理生化鑒定 將菌株分別在無(wú)菌條件下穿刺接種于細(xì)菌生化鑒定管中，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)的理化特性測(cè)定[3]。

1.2.3 16S rDNA基因的擴(kuò)增 采用16S rDNA通用引物（上游16SF：5’-CTAAGCCAGGATCAAACTCT-3’；下游16SR：5’-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’）。 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的DNA作為模板，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶大小。陽(yáng)性樣品由華大基因公司測(cè)序。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B法對(duì)分離菌株的藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。將培養(yǎng)16 h的該分離菌菌液涂布在檢測(cè)平板上，平板于室溫中放置4 min等待干燥，在合適區(qū)域貼上藥敏紙片，室溫放置10 min后，倒置于28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，在黑色無(wú)反光的背景下測(cè)量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌圈直徑，判定該菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀 患病的瓦氏雅羅魚(yú)鱗片大面積脫落，身體表面存在多處出血，鰓蓋和眼周出血，尾部有潰爛。

2.2 細(xì)菌形態(tài) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落為圓形、不透明、表面光滑、隆起及邊緣整齊，菌落為中等大小。染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性的短桿狀細(xì)菌。

2.3 理化特性 由分離菌的生化鑒定結(jié)果可知，該菌株不具有動(dòng)力性，枸櫞酸鹽、氧化酶、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、賴氨酸脫氫酶、尿素、蔗糖和VP試驗(yàn)均為陰性，半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷和葡萄糖試驗(yàn)為陽(yáng)性。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，將其初步判定為殺鮭氣單胞菌。

2.4 16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果及序列分析 以分離細(xì)菌的DNA為模板，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約1 500 bp的核酸片段（見(jiàn)圖1）。將分離菌的測(cè)序結(jié)果用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明該序列和殺鮭氣單胞菌的殺鮭亞種代表株相似性在99%以上，表明該菌株為殺鮭氣單胞菌。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)表明，該分離菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、阿米卡星等抗生素敏感，對(duì)利福平、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等中度敏感，對(duì)青霉素、甲氧卞胺嘧啶、卡那霉素等藥物耐受。

2.6 用藥結(jié)果 根據(jù)上述藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇強(qiáng)力霉素和阿米卡星拌料治療，同時(shí)在池水中加入抗菌中草藥，對(duì)發(fā)病的魚(yú)池采用聚維酮碘消毒，短時(shí)間內(nèi)有效地控制了該疫情。

3 討論

殺鮭氣單胞菌可引起鮭魚(yú)科、鯉科等魚(yú)類產(chǎn)生皮膚潰爛等癥狀，以至出現(xiàn)敗血癥、死亡，對(duì)魚(yú)類養(yǎng)殖和魚(yú)種保護(hù)造成嚴(yán)重的損失［4-5］。本試驗(yàn)中瓦氏雅羅魚(yú)感染殺鮭氣單胞菌的原因可能是魚(yú)剛到新的水體環(huán)境中，由于應(yīng)激和飼養(yǎng)模式變化等原因，導(dǎo)致魚(yú)的抵抗力下降，從而感染該菌，導(dǎo)致疾病。動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中常選用抗生素進(jìn)行細(xì)菌性疾病的防治，但其選擇和使用需要有科學(xué)性，長(zhǎng)期不合理使用同種藥可誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性，藥物會(huì)失去作用，動(dòng)物體內(nèi)也會(huì)有大量藥殘。因此，在選擇藥物前需要做好藥敏試驗(yàn)，合理慎重用藥。本研究可為進(jìn)一步研究殺鮭氣單胞菌的防治奠定基礎(chǔ)，為殺鮭氣單胞菌感染的臨床用藥提供參考。

[1]孟和平，韓國(guó)蒼，高玉奎，等．達(dá)里湖鯽魚(yú)、瓦氏雅羅魚(yú)資源的可持續(xù)發(fā)展[J]．當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2015（10）：48．

[2]王海娟，王利．鯉魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015（1）：192-196．

[3]蔡妙英，東秀珠．常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]．北京：科學(xué)出版社，2001：364-399．

[4]劉寧，時(shí)曉，杜迎春，等．患病細(xì)鱗魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離與鑒定[J]．淡水漁業(yè)，2015（1）：88-92．

[5]王家禎，耿昕穎，董文龍，等．3株殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2017（2）：78-80．