乳腺良惡性腫瘤組織中CD44的表達(dá)及其與淋巴管生成的關(guān)系*

王 倩，勞淑貞，樸金松，高蔚櫻，趙 凱，張東輝，譚小軍，羅 凱

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州 510095)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的重要惡性腫瘤，在中國其發(fā)病率逐年升高且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，因此尋找新的鑒別診斷指標(biāo)來盡早診斷乳腺癌對(duì)于乳腺癌的防治具有重要意義。同時(shí)，乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要因素，而淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌最重要的轉(zhuǎn)移途徑之一。相關(guān)研究［1］表明乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移與淋巴管生成密切相關(guān)，所以檢測(cè)淋巴管生成可有效預(yù)測(cè)乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)。然而因缺乏淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物導(dǎo)致淋巴管生成與毛細(xì)血管在鏡下難以區(qū)分，從而影響了準(zhǔn)確的淋巴管生成檢測(cè)［2］。細(xì)胞黏附分子44(celladhesion molecule-44，CD44)是一種跨膜透明質(zhì)酸受體，其不僅介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，而且其也參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)［3］。近來研究［4，5］表明CD44參與調(diào)節(jié)了乳腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程，同時(shí)其還參與了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖過程。那么CD44是否可作為乳腺癌的鑒別診斷指標(biāo)和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，目前相關(guān)研究較少。該研究擬采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD44在乳腺癌和良性乳腺腫瘤的腫瘤組織和淋巴管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，以探討CD44在乳腺良惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及其作為乳腺癌輔助鑒別診斷指標(biāo)和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2005年1月～2015年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤患者存檔蠟塊75例，均為女性，平均年齡46.30±11.15歲。其中乳腺良性腫瘤組(乳腺腺病與纖維腺瘤)25例，均為女性，平均年齡34.32±5.46歲;乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組25例，均為女性，平均年齡48.40±10.85歲;乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，均為女性，平均年齡49.80±8.41歲。所有患者術(shù)前均未接受過化療與放療。

1.2 試劑和儀器 兔抗人CD44單克隆抗體購自上?；蚬?，SP免疫組織化學(xué)試劑盒與DAB顯色劑購自丹麥DAKO公司，顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色:石蠟切片65℃烤片1～2h，二甲苯和乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水沖洗去余色，0.7 g/dl鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗15 min至切片變藍(lán)，95 ml/dl乙醇30 s，酒精性伊紅染色 30 s，95 ml/dl乙醇 30 s，95 ml/dl乙醇 30 s，無水乙醇30 s，無水乙醇30 s，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯30 s，中性樹膠封片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色:將厚5 μm的石蠟切片附于防脫玻片上，65℃烤片1～2h，二甲苯和乙醇脫蠟至水;抗原修復(fù):枸櫞酸緩沖液，熱修復(fù)20 min，PBS洗3次，每次5 min;3 ml/dl雙氧水，室溫10 min，PBS洗3次，每次5 min;滴加山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體;切片滴加生物素化一抗，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min;切片滴加生物素化二抗，37℃20 min，PBS洗3次，每次5 min;切片滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃20 min，PBS洗3次，每次5 min;切片滴加DAB工作液，室溫孵育5～10 min;用蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染;梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片膠封片;光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行圖像分析。

1.3.3 CD44免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀:CD44陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為有棕黃色顆粒沉積，在良性乳腺腫瘤樣品中CD44表達(dá)于乳腺上皮細(xì)胞中，在乳腺癌樣品中CD44表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿中。免疫組織化學(xué)評(píng)分由兩部分組成，A為按細(xì)胞顯色的程度記分:無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;B為按細(xì)胞顯色的范圍百分比記分:＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。免疫組織化學(xué)最終評(píng)分結(jié)果為A得分乘以B得分。

1.3.4 淋巴管形態(tài)比較和生成數(shù)目計(jì)數(shù):淋巴管形態(tài)的比較在顯微鏡下進(jìn)行，由高年資病理醫(yī)生負(fù)責(zé)觀察。淋巴管生成數(shù)目計(jì)數(shù)方法:以CD44作為識(shí)別淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，在100倍光鏡下選出3個(gè)淋巴結(jié)最豐富的熱點(diǎn)，由2名高年資病理醫(yī)生在200倍光鏡下盲法閱片，每個(gè)熱點(diǎn)計(jì)數(shù)淋巴管5次，取均值。

1.3.5 生物信息學(xué)分析:在Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)中分析CD44在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)差異，用以驗(yàn)證該研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，其中組間兩兩比較采用LSD法分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組乳腺腫瘤樣品HE染色后的鏡下形態(tài)特征觀察 鏡下可見良性乳腺腫瘤組中以乳腺纖維腺瘤及乳腺腺病為主，腺病中乳腺小葉終末導(dǎo)管和腺管增生，或者小葉增多，纖維腺瘤中可見增生的腺上皮、肌上皮細(xì)胞及纖維性間質(zhì)，間質(zhì)可見玻璃樣變，黏液樣變性。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組樣品鏡下形態(tài)特征無明顯差異，均可見癌細(xì)胞排列呈索狀、簇狀、小梁狀或?qū)嵭?，?xì)胞形狀各異，核大，胞漿豐富。

2.2 CD44在三組乳腺腫瘤樣品中的表達(dá) 在乳腺良性腫瘤組中，有15例未見癌細(xì)胞CD44表達(dá)，僅10例可見癌細(xì)胞CD44弱陽性表達(dá)，CD44陽性表達(dá)率為40%，免疫組織化學(xué)評(píng)分結(jié)果為0.60±0.82。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，CD44均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為100%，免疫組織化學(xué)評(píng)分結(jié)果分別為3.16±2.70和3.52±2.47。三組樣品間CD44表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.52，P＜0.0001)。其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的CD44表達(dá)水平均較乳腺良性腫瘤組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間CD44表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.24，P=0.6252)。

2.3 三組乳腺腫瘤中的淋巴管生成情況 三組乳腺腫瘤組中，均可見CD44在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，故以CD44作為淋巴管生成的特異性標(biāo)記物計(jì)數(shù)三組樣品中的淋巴管生成數(shù)。在乳腺良性腫瘤組、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，淋巴管生成數(shù)分別為4.08±2.43，13.80±13.54 和 12.72±13.69，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.94，P=0.0097)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組樣品中的淋巴管生成數(shù)均較乳腺良性腫瘤組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間樣品中的淋巴管生成數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.08，P=0.7804)。

2.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析CD44基因在多種腫瘤和相應(yīng)正常組織中的表達(dá)情況可見，CD44在乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)直腸癌、頭頸腫瘤等多種腫瘤的癌組織中高表達(dá)。同時(shí)在TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫的64例乳腺癌相關(guān)研究數(shù)據(jù)中，3例乳腺癌組織的CD44表達(dá)水平較61例正常乳腺組織增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.108，P=0.006)。

3 討論乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其防治工作對(duì)保護(hù)女性健康具有重要意義。然而腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多階段發(fā)展的長(zhǎng)期過程，且在形態(tài)學(xué)上早期惡性腫瘤大多難以與良性腫瘤進(jìn)行鑒別，因此尋找新的輔助鑒別診斷指標(biāo)對(duì)于乳腺癌的早診早治具有重要的實(shí)用價(jià)值。

CD44是一種細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白，其編碼基因位于11號(hào)染色體上，由20個(gè)外顯子構(gòu)成，其中10個(gè)外顯子為組成型外顯子，另外10個(gè)外顯子為變異性拼接外顯子［6］。CD44基因可編碼標(biāo)準(zhǔn)型CD44蛋白(standard form，CD44s)和變異型CD44蛋白(variant form，CD44v)，其中 CD44s蛋白僅由組成型外顯子編碼，而CD44v蛋白則由組成型外顯子和變異性拼接外顯子共同編碼，且兩種外顯子的具體組合形式多樣可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多個(gè)CD44v蛋白亞型。

CD44最初被發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的歸巢與遷移。近年研究表明，CD44在乳腺癌、胃腸道腫瘤和泌尿系統(tǒng)腫瘤等惡性腫瘤中表達(dá)增加。Wang等［4］檢測(cè)了921例乳腺癌患者的CD44表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比乳腺癌的CD44表達(dá)水平明顯增加。2003年AI-Hajj首次利用CD44作為標(biāo)記物自乳腺癌細(xì)胞中成功分離了乳腺癌干細(xì)胞，自此CD44作為重要標(biāo)記物之一被廣泛用于乳腺癌干細(xì)胞的分離、鑒定和機(jī)制研究［7］。Senel等［8］發(fā)現(xiàn) CD44 在正常胃黏膜中不表達(dá)，但在45%的胃癌腫瘤組織中表達(dá)且CD44高表達(dá)的患者其生存期更短。以上研究結(jié)果表明CD44參與了乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生并與預(yù)后不良相關(guān)。在該研究中發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者不僅在CD44的陽性率上高于良性乳腺腫瘤患者而且CD44的表達(dá)水平也顯著升高，同時(shí)生物信息學(xué)分析也顯示出同樣的結(jié)果。提示CD44不僅參與乳腺癌的發(fā)生而且可以作為乳腺癌與良性乳腺腫瘤的鑒別診斷指標(biāo)。

Lu等［9］定量分析了 2177例胃癌患者中CD44v6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD44v6與淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與淋巴管、血管侵犯、生成有關(guān)。Liu等［10］利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了109例宮頸鱗狀細(xì)胞癌CD44v3和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD44v3在中度和低度分化的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中廣泛分布且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤栓子的形成相關(guān)，提示CD44v3與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。以上研究結(jié)果提示CD44參與調(diào)節(jié)了腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲，但在不同腫瘤中參與轉(zhuǎn)移侵襲調(diào)節(jié)的CD44亞型有所不同。在該研究中，CD44在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與部分相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果不一致。分析其原因可能有二:一為該研究使用的CD44抗體為通用型抗體僅能檢測(cè)CD44的總表達(dá)量而不能區(qū)分具體亞型，但與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD44僅為部分特定亞型;二為不同亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)分子譜有差別。

惡性腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移是一個(gè)主動(dòng)的過程，在腫瘤發(fā)展到一定階段時(shí)會(huì)異常分泌一些因子促進(jìn)腫瘤周邊淋巴管的新生，而新生的淋巴管則會(huì)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［2］。但是由于缺少特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物導(dǎo)致惡性腫瘤經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)研究滯后于經(jīng)新生血管轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。D2-40和Podoplanin等是新近發(fā)現(xiàn)的淋巴管特異性標(biāo)記物，可由于部分標(biāo)記物與血管內(nèi)皮細(xì)胞存在一定的交叉反應(yīng)或具有組織特異性，故仍需繼續(xù)尋找新的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物［11］。近來研究表明，CD44等黏附分子參與了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成等淋巴管新生過程。Karunamuni等［12］研究發(fā)現(xiàn)成人心臟有一個(gè)廣泛的淋巴系統(tǒng)，CD44可作為該淋巴網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)記物。張文彩等［5］研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD44分子且CD44參與了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成等淋巴管新生過程。以上研究表明CD44是淋巴管新生過程中的重要分子并有望成為部分組織器官內(nèi)淋巴系統(tǒng)的特異性標(biāo)記物。在該研究中，以CD44作為乳腺的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物可有效輔助病理醫(yī)生在鏡下識(shí)別淋巴管并進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中淋巴管的生成明顯增加，提示乳腺癌的發(fā)生發(fā)展也與淋巴管的生成相關(guān)。該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相符，表明以CD44作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物來輔助淋巴管生成計(jì)數(shù)可取得與其他淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物相同的效果。因此CD44在乳腺中可作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的標(biāo)記物。同時(shí)以CD44作為乳腺淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物還具有在鑒別診斷乳腺癌的同時(shí)無需另外染色就可實(shí)現(xiàn)淋巴管生成檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，更加經(jīng)濟(jì)并省時(shí)、省力。

綜上所述，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與CD44表達(dá)增高以及淋巴管的生成有關(guān)。同時(shí)CD44可作為乳腺癌與乳腺良性腫瘤的輔助鑒別診斷指標(biāo)和乳腺淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。