復合微生物制劑對小鼠生長性能及免疫功能的影響

張 偉

（安慶醫(yī)藥高等?？茖W校臨床醫(yī)學系，安徽安慶246052）

復合微生物制劑是指由兩種或兩種以上互不拮抗的微生物菌種經(jīng)科學配方合成的制劑，具有配伍合理、優(yōu)良性強等優(yōu)點。目前，關(guān)于復合微生物制劑功能的研究大多集中于改善土壤環(huán)境、提升水產(chǎn)動物生長性能，改善水體環(huán)境等方面［1-3］。劉軍輝研究表明，施用復合微生物制劑后，鹽堿地土壤PH、EC值顯著下降，土壤微生物數(shù)量及肥力逐年提升，土壤改良效果明顯［4］。楊桂芳等研究表明，利用復合微生物制劑處理制藥廠廢水效果顯著優(yōu)于單一微生物處理，凈化制藥廢水效果顯著［5］。呂遠蓉等研究表明，飼喂復合微生態(tài)制劑可顯著提升肉雞生長性能，同時腸道微生物菌群顯著改善，屠宰性能提高［6］。符冬巖等研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加復合微生物制劑可顯著提升鯉魚生產(chǎn)性能，同時浮游動植物數(shù)量明顯下降，水質(zhì)顯著改善［7］。王雄等研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加復合微生物制劑可顯著提升銀鯽的血清溶菌酶活性［8］。而關(guān)于復合微生物制劑對動物機體免疫功能的影響方面的研究報道尚不多見。因此，本文研究了自行研制的復合微生物制劑對小鼠生長性能及免疫功能的影響，以期為將來開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 實驗材料

實驗用小鼠為6周齡昆明種雄性SPF級小鼠及基礎(chǔ)日糧購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。復合微生物制劑主要由光合細菌、乳酸菌、酵母菌及芽孢桿菌組成，自行研制。刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑藍（NTT）購自美國sigma公司，新生牛血清購自美國gibco公司，綿羊紅細胞（SRBC）、淋巴細胞裂解液購自上海生工生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購自天津瑞金特化學品公司。

1.1.2 實驗儀器

BS224S型電子天平，Thermo 3032型CO2培養(yǎng)箱，200XUSB型電子顯微鏡，D-35720型離心機，DG5033型酶標儀，鍍鉻游標卡尺，L5型紫外可見分光光度計，DK-S22恒溫水浴鍋，SW-CJ-2G超凈工作臺等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗設計與飼養(yǎng)

選取200只6周齡的昆明種SPF級雄性小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為4組，每組50只，稱量其體重并記作為初始體重。分組飼養(yǎng)階段，將復合微生物制劑分別按照日糧的3%（低劑量組）、6%（中劑量組）和9%（高劑量組）加入到飼料中，攪拌均勻，直接飼喂。實驗組小鼠采取同室分籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)清潔衛(wèi)生，控制晝夜交替12 h，溫度23℃，濕度50-60%，采食飲水自由，飼養(yǎng)6周后，饑餓過夜12 h，稱重、解剖采樣，進行相關(guān)指標測定。

1.2.2 小鼠免疫器官指數(shù)測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠的脾臟和胸腺進行稱重，并按照如下公式計算免疫器官指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.3 小鼠血清半數(shù)溶血值HC50測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別注射0.2 mL的2%綿羊紅細胞懸浮液進行免疫，4 d后摘除眼球并分離血清，采用曹發(fā)昊的方法［9］進行血清半數(shù)溶血值HC50測定。

1.2.4 小鼠溶血空斑數(shù)測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別注射0.2 mL的2%綿羊紅細胞懸浮液進行免疫，4d后摘除脾臟并制備脾細胞懸浮液，按照改良玻片法［10］測定溶血空斑數(shù)。

1.2.5 小鼠淋巴細胞增值能力測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠無菌取脾臟，制備細胞懸浮液，用刀豆蛋白（ConA）對脾淋巴細胞進行刺激，采用MTT比色法［11］測定小鼠脾淋巴細胞的增值能力。

1.2.6 小鼠足跖厚度測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠分別于腹腔注射0.2 mL 5%的綿羊紅細胞，經(jīng)4 d致敏反應，測量各小鼠左后足跖厚度。在測量部位二次注射20 μL 20%的綿羊紅細胞，進行二次致敏，于24 h后測定其厚度，并計算2次測量的厚度差值。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數(shù)測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別于腹腔注射1 ml20%的雞紅細胞懸浮液，采用頸椎脫臼法處死，采用柳璐的方法［12］計算巨噬細胞數(shù)、吞噬雞紅細胞巨噬細胞數(shù)和被吞噬雞紅細胞數(shù)，并采用如下公式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率＝吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)／計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞數(shù)總數(shù)／計數(shù)的巨噬細胞數(shù)。

1.2.8 小鼠碳粒廓清指數(shù)測定

末次飼喂1 h后，每組選取10只小鼠分別從鼠尾靜脈處注射0.05 mL·1og-1g的稀釋印度墨汁，并按如下公示計算碳粒廓清指數(shù)：K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），其中，OD1為t1時（2 min）血標本光密度值，OD2為t2時（10 min）血標本光密度值。

1.2.9 小鼠NK細胞活性測定

飼喂實驗結(jié)束后，每組取10只小鼠無菌取脾，并制備成單細胞懸浮液，采用乳酸脫氫酶法［13］分別測定反應孔OD值、自然釋放孔OD值和最大釋放孔OD值，并按照如下公式計算NK細胞活性：NK細胞活性（%）=（反應孔OD值-自然釋放孔OD值）/（最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值）×100%。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 復合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響

不同劑量的復合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響如表1所示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的初始體重統(tǒng)計學差異不顯著，但是經(jīng)飼養(yǎng)5周后，4組小鼠的平均體重分別增長 10.95 g、12.86 g、14.43 g 和 14.69 g。與對照組相比，低劑量組復合微生物制劑處理顯著增加小鼠的體重，中劑量組和高劑量組處理極顯著增加小鼠體重。這表明，復合微生物制劑處理會顯著增加的小鼠的生長性能。

表1 復合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響（n=10）

2.2 復合微生物制劑處理對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是小鼠重要的免疫器官，對免疫功能具有顯著影響。復合微生物制劑處理對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響如表2所示，與對照組相比，復合微生物制劑處理顯著增加了小鼠脾臟指數(shù)，其中，中劑量組增加幅度最大，達到1.47 mg·g-1；與對照組相比，低劑量組復合微生物制劑處理顯著增加小鼠胸腺指數(shù)，而中、高劑量組處理則極顯著增加小鼠胸腺指數(shù)，其中，高劑量組增加幅度最大，達到0.7 mg·g-1。這表明，復合微生物制劑處理可顯著增加小鼠的免疫器官指數(shù)。

表2 復合微生物制劑處理對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10）

2.3 復合微生物制劑處理對小鼠體液免疫功能的影響

血清半數(shù)溶血值HC50和溶血空斑數(shù)是衡量動物體液免疫功能強弱的重要指標。復合微生物制劑處理對小鼠血清半數(shù)溶血值HC50和溶血空斑數(shù)的影響如表3所示，與對照組相比，低劑量組復合微生物制劑處理可顯著增加小鼠血清半數(shù)溶血值和溶血空斑數(shù)，中、高劑量組復合微生物制劑處理可極顯著增加小鼠血清半數(shù)溶血值和溶血空斑數(shù)，其中高劑量組處理增加幅度最大，分別達到18.05，24.5。這表明，低劑量復合微生物制劑處理可顯著增加小鼠體液免疫功能，中、高劑量組處理可極顯著增加小鼠體液免疫功能。

表3 復合微生物制劑處理對小鼠體液免疫功能的影響（n=10）

2.4 復合微生物制劑處理對小鼠細胞免疫功能的影響

淋巴細胞增值能力和足跖厚度與小鼠細胞免疫功能強弱息息相關(guān)。復合微生物制劑處理對小鼠細胞免疫功能的影響如表4所示，與對照組相比，低、中劑量組復合微生物制劑處理顯著增強小鼠的淋巴細胞增長能力，高劑量組處理極顯著增強小鼠淋巴細胞增長能力，最大增幅達到0.075；與對照組相比，低、中劑量組復合微生物制劑處理顯著增加了足跖厚度，高劑量組處理極顯著增強小鼠足跖厚度，最大增幅達到0.15 mm。這表明，低、中劑量的復合微生物制劑處理可顯著增加小鼠的細胞免疫功能，而高劑量組的復合微生物制劑可極顯著增加小鼠的細胞免疫功能。

表4 復合微生物制劑處理對小鼠細胞免疫功能的影響（n=10）

2.5 復合微生物制劑處理對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

巨噬細胞是動物免疫細胞的重要類型，通過吞噬病原體來實現(xiàn)機體的免疫功能。復合微生物制劑處理對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響如表5所示，與對照組相比，低劑量的復合微生物制劑處理可顯著提升小鼠巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)及碳粒廓清指數(shù)；與對照組相比，中、高劑量組復合微生物制劑處理可極顯著提高小鼠巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)及碳粒廓清指數(shù)，增幅分別達到12.8%、0.11及1.95。這表明，低劑量的復合微生物制劑處理可顯著提升小鼠巨噬細胞吞噬功能，中、高劑量復合微生物制劑處理可極顯著提升小鼠巨噬細胞的細胞吞噬功能。

表5 復合微生物制劑處理對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響（n=10）

2.6 復合微生物制劑處理對小鼠NK細胞活性的影響

自然殺傷細胞（natural kill cell，NK）是動物體內(nèi)一類與B、T淋巴細胞并列的非常重要的免疫細胞，具有殺傷介質(zhì)、識別靶細胞等重要功能，不僅與自身免疫調(diào)節(jié)、抗病毒感染等息息相關(guān)，而且與時常參與超敏反應等的發(fā)生。復合微生物制劑處理對小鼠NK細胞活性的影響如圖1所示，與對照組相比，低、中、高劑量組復合微生物制劑處理均可顯著提升NK細胞的活性，其中，高劑量組復合微生物制劑處理提升幅度最大，達到79.58%。這表明，復合微生物制劑處理可顯著提升自然殺傷細胞的活性，提升免疫功能。

3 結(jié)論

動物的免疫系統(tǒng)由免疫器官、細胞、分子等組成，是機體發(fā)生免疫反應的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫器官指數(shù)是初步衡量機體免疫功能的指標，而以B、T細胞為主的體液免疫和細胞免疫則是反應機體免疫調(diào)節(jié)功能的重要參數(shù)，巨噬細胞的吞噬能力是衡量動物機體非特異性免疫功能強弱的重要指標，NK細胞是與B、T細胞并列的第三類群淋巴細胞，其活性高低與機體免疫功能強弱顯著相關(guān)。因此，本研究從免疫器官指數(shù)、體液免疫、細胞免疫、巨噬細胞吞噬及NK細胞活性等方面研究了復合微生物制劑處理對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明，復合微生物制劑不僅提升了小鼠的生長性能而且顯著提高了小鼠的機體免疫功能，其中尤以中、高劑量處理效果最佳。

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