荊半夏組織培養(yǎng)及快速繁殖研究

饒茜茜，段思，葉子榮，王玉杰 劉秀秀，張建，趙振軍

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

半夏(PinelliaTernata(Thunb.)Breit.)又名老鴉芋頭、野芋頭、地巴豆等，是天南星科半夏屬的一種多年生植物，其塊莖入藥，具有潤(rùn)燥化痰、降逆止嘔等功效[1]，是一類需求量非常大的中藥。半夏分布面積廣，除內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、青海、新疆、西藏外，其他各省區(qū)均有分布，以四川、貴州、云南、甘肅、湖北、山東、安徽資源較多[2]?！扒G半夏”(因產(chǎn)于湖北荊州地區(qū)而得名)具有品質(zhì)佳、質(zhì)量?jī)?yōu)等特點(diǎn)，是半夏中的佳品，深受各地藥商的青睞，在全國(guó)半夏產(chǎn)品中一直屬于緊俏藥材。隨著近年來(lái)對(duì)荊半夏的需求量不斷增加，野生資源進(jìn)一步枯竭。通過(guò)大力推廣人工栽培，并探索行之有效的快速繁殖技術(shù)，可在解決其由于資源短缺制約半夏產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)荊半夏品種資源的優(yōu)化與快速利用。

荊半夏種子結(jié)實(shí)率、萌芽率低，常以塊莖繁殖為主，但塊莖繁殖系數(shù)低，而且耗種量大，難以進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)。目前，已對(duì)半夏葉片、葉柄、珠芽等外植體愈傷組織的誘導(dǎo)與分化特征進(jìn)行了研究[3～10]，在半夏、荊半夏組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)的探索上取得了一定的進(jìn)展，但是還沒(méi)有荊半夏組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的報(bào)道。因此，本研究在前人的基礎(chǔ)上，以荊半夏的葉片、葉柄、珠芽、塊莖作為外植體，設(shè)計(jì)了不同激素配比的培養(yǎng)基，對(duì)荊半夏進(jìn)行了離體培養(yǎng)及快繁技術(shù)的研究，旨在建立一套簡(jiǎn)單實(shí)用且易推廣的荊半夏組培快繁技術(shù)體系，為荊半夏產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

精選優(yōu)質(zhì)野生荊半夏，取其葉片、葉柄、珠芽、塊莖為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌

選擇完整的半夏植株，取其葉片、葉柄、珠芽、塊莖作為外植體，自來(lái)水沖洗干凈。于超凈工作臺(tái)中用75%的乙醇浸泡30s，然后用無(wú)菌水沖洗3～5遍，再置于0.1%升汞溶液中消毒15min，期間不斷搖動(dòng)，取出后用無(wú)菌水再?zèng)_洗 3～5遍。將外植體置于三角瓶中備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配置

基本培養(yǎng)基為MS，設(shè)計(jì)5種不同的激素配比：①M(fèi)S+6-BA (6-芐氨基腺嘌呤) 1.0mg/L+NAA (萘乙酸)1.0mg/L；②MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；③MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L；④MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L；⑤MS+NAA 0.5mg/L。以上培養(yǎng)基其他條件均為：pH 5.8，瓊脂7.0 g/L，蔗糖3%。

1.2.3 接種與培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中將消毒好的材料置于無(wú)菌濾紙上晾干后，將葉片切成0.1cm×0.1cm、葉柄切成2.0cm、塊莖和珠芽切成0.5cm3，分別接種在上述①～④號(hào)培養(yǎng)基中。接種方式：葉片背面接觸培養(yǎng)基，葉柄橫向放置，珠芽和塊莖水平置于培養(yǎng)基。

培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx,光照時(shí)間12h。

1.2.4 生根培養(yǎng)

當(dāng)葉片、葉柄、珠芽、塊莖形成的小苗長(zhǎng)到5～8cm 長(zhǎng)時(shí)分別轉(zhuǎn)接到⑤號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7d后長(zhǎng)出大量根系。

1.2.5 煉苗和移栽馴化

當(dāng)幼苗長(zhǎng)出3～4片葉,根長(zhǎng)3～5cm左右時(shí),開始煉苗：第1d將培養(yǎng)瓶蓋半打開，于溫室內(nèi)煉苗,3d后將培養(yǎng)瓶蓋全打開，煉苗5d后將苗取出,用清水洗凈根部的瓊脂,種植與營(yíng)養(yǎng)土中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

營(yíng)養(yǎng)土配比：蛭石∶泥炭∶珍珠巖=1∶1∶1。

培養(yǎng)條件：溫度22～25℃；濕度85%。當(dāng)培養(yǎng)箱中的小苗適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并正常生長(zhǎng)后將小苗移至大田栽培。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種8d后②號(hào)培養(yǎng)基葉片突起，邊緣處形成少量白色愈傷組織；20d后形成大量淺綠色愈傷組織；30d后愈傷組織上開始分化出綠色突起小珠芽；40d后每個(gè)愈傷組織上形成2～3個(gè)珠芽；50d后生成叢生芽。接種在其他3種培養(yǎng)基中的葉片生長(zhǎng)均較慢，且最終生成的小苗也比②號(hào)少(表1)。其中③號(hào)培養(yǎng)基中的葉片20d后才開始形成少量愈傷組織，可能是由于NAA濃度過(guò)高，抑制愈傷組織的形成，故②號(hào)培養(yǎng)基最適合葉片愈傷組織的形成和芽的分化。

表1 不同激素配比下的半夏葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率和芽分化率

2.2 不同激素配比對(duì)葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種9d后②號(hào)培養(yǎng)基葉柄兩端卷起，傷口處出現(xiàn)膨大；25d后形成大量白色愈傷組織；35d后愈傷組織上開始分化出綠色綠色突起小珠芽； 40d后每個(gè)愈傷組織上形成3～5個(gè)珠芽；50d后生成叢生芽(表2)。接種在其他3種培養(yǎng)基中的葉柄與②號(hào)培養(yǎng)基葉柄膨大時(shí)間一致，但愈傷組織形成時(shí)間均比②號(hào)培養(yǎng)基慢，且成苗率也較低，故②號(hào)培養(yǎng)基最適合葉柄愈傷組織的形成和芽的分化。

表2 不同激素配比下的半夏葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率和芽分化率

2.3 不同激素配比對(duì)珠芽愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種5d后①號(hào)培養(yǎng)基中珠芽與培養(yǎng)基接觸面形成少量顆粒狀白色愈傷組織；15d后整個(gè)珠芽表面長(zhǎng)滿白色愈傷組織，25d后愈傷組織開始分化出小珠芽；35d后每個(gè)愈傷組織上形成6～9個(gè)珠芽；45d后生成大量叢生芽，同時(shí)珠芽基部開始生根(表3)。接種在其他3種培養(yǎng)基中的半夏珠芽愈傷組織和芽分化時(shí)間均較長(zhǎng)，且愈傷誘導(dǎo)率和芽分化率都不高，故珠芽的最適培養(yǎng)基為①號(hào)培養(yǎng)基。

表3 不同激素配比下的半夏珠芽愈傷組織誘導(dǎo)率和芽分化率

2.4 不同激素配比對(duì)塊莖愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種6d后①號(hào)培養(yǎng)基中塊莖與培養(yǎng)基接觸面形成少量顆粒狀白色愈傷組織，20d后形成大量愈傷組織；30d后愈傷組織開始分化出小珠芽；40d后生成大量叢生芽，同時(shí)塊莖基部開始生根。其他3種培養(yǎng)基中塊莖愈傷組織誘導(dǎo)率均低于①號(hào)培養(yǎng)基，且分化時(shí)間較長(zhǎng)，分化率也不高，故塊莖的最適培養(yǎng)基為①號(hào)培養(yǎng)基(表4)。①號(hào)培養(yǎng)基中一個(gè)外植體最終形成的小苗數(shù)最高達(dá)20個(gè)，且煉苗移栽后還有分化出小苗的趨勢(shì)。

表4 不同激素配比下的半夏塊莖愈傷組織誘導(dǎo)率和芽分化率

2.5 同一培養(yǎng)基不同外植體生長(zhǎng)比較

從圖1可以看出，①號(hào)培養(yǎng)基塊莖誘導(dǎo)出13個(gè)小苗，珠芽誘導(dǎo)出7個(gè)小苗，葉柄誘導(dǎo)出4個(gè)小苗，葉片誘導(dǎo)出3個(gè)小苗，說(shuō)明4種不同外植體均能在①號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出荊半夏小苗。塊莖、珠芽在①號(hào)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)個(gè)數(shù)明顯高于葉柄和珠芽，說(shuō)明①號(hào)培養(yǎng)基適合以塊莖和珠芽為外植體快速繁殖小苗，與前述觀察結(jié)果一致。

圖1 ①號(hào)培養(yǎng)基下4種外植體生長(zhǎng)情況

圖2 不同外植體移栽情況(移栽20d后)

2.6 組織培養(yǎng)苗移栽效果

將塊莖、珠芽、葉柄、葉片分化出的荊半夏小苗移栽到同一基質(zhì)中，20d后將不同外植體培養(yǎng)出的荊半夏植株進(jìn)行對(duì)比。由圖2可知，塊莖誘導(dǎo)出的植株株高15.0cm，根長(zhǎng)4.0cm，生根數(shù)20根；珠芽誘導(dǎo)出的植株株高13.0cm，根長(zhǎng)1.5cm，生根數(shù)7根；葉柄誘導(dǎo)出的植株株高15.0cm，根長(zhǎng)4.0cm，生根數(shù)6根；葉片誘導(dǎo)出的植株株高9.5cm，根長(zhǎng)4.0cm，生根數(shù)8根。說(shuō)明在同一基質(zhì)的培養(yǎng)下塊莖誘導(dǎo)出的植株適應(yīng)大田栽培環(huán)境的能力最強(qiáng)，葉柄、珠芽誘導(dǎo)出的植株次之，葉片誘導(dǎo)出的植株最弱。而且在栽培過(guò)程中發(fā)現(xiàn)葉片誘導(dǎo)出的荊半夏植株不易存活，生長(zhǎng)力弱，故葉片誘導(dǎo)出的植株不適合大田栽培。

3 討論與結(jié)論

本研究以荊半夏的葉片、葉柄、珠芽、塊莖作為外植體，對(duì)荊半夏進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，在同樣的激素配比條件下，珠芽、塊莖的誘導(dǎo)率及分化率顯著高于葉片和葉柄，其中塊莖的誘導(dǎo)率和分化率最高，達(dá)到95%，說(shuō)明珠芽、塊莖比葉片、葉柄的分化能力強(qiáng)，這與顧明化[11]的結(jié)論一致。

在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，接種在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培養(yǎng)基中的珠芽和塊莖在分化的過(guò)程中伴隨著生根過(guò)程，不需要轉(zhuǎn)接到MS+NAA 0.5mg/L生根培養(yǎng)基中就可以分化成帶根小苗，且在煉苗移栽后MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培養(yǎng)基中是珠芽和塊莖還會(huì)繼續(xù)分化出小苗，即達(dá)到了快速繁殖的目的也縮短了半夏的繁育周期，說(shuō)明MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培養(yǎng)基最適合珠芽和塊莖培養(yǎng)，可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

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[編輯] 余文斌