HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用及中醫(yī)藥研究進(jìn)展※

曹 穎 杜晨光 白素芬 劉慧娟 謝 偉

（華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs），簡稱內(nèi)異癥，是一種子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮腔以外的雌激素依賴性疾病。在育齡期女性中的發(fā)病率為10%，在不孕女性中的發(fā)病率高達(dá)30%~45%[1]。主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、盆腔痛及不孕，嚴(yán)重困擾著處于黃金時期的部分女性。雖然EMs的病因?qū)W說眾多，但均無法完美解釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程。病因不清已成為困擾EMs治療研究的重要瓶頸。EMs被認(rèn)為是一種慢性感染性疾病[2]，同時病灶局部存在雌激素增多，性激素信號通路異常[3-4]，異位內(nèi)膜組織表現(xiàn)為異常的細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成特性，這些生物學(xué)特征的改變與缺氧密切相關(guān)[5-6]。缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α） 已成為EMs的研究熱點(diǎn)。

根據(jù)被大多數(shù)學(xué)者所接受的異位種植學(xué)說，EMs源于脫落的內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流進(jìn)入腹腔，經(jīng)“黏附-侵襲-血管形成”三部曲，種植于腹腔或其他臟器表面[7]。經(jīng)期子宮內(nèi)膜的螺旋小動脈收縮，使內(nèi)膜處于缺氧狀態(tài)[8]，內(nèi)膜碎片進(jìn)入腹腔后，缺氧將持續(xù)存在。而適度的缺氧恰恰能夠減少內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)胞的異位種植[9]。細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)，提高了異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲能力[10]，促進(jìn)了血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[11]，說明HIF-1α在EMs的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，內(nèi)異癥屬血瘀證范疇，活血化瘀是治療內(nèi)異癥的基本大法。活血化瘀藥物對于子宮內(nèi)膜異位病灶缺氧環(huán)境有著怎樣的影響，中醫(yī)藥研究者做了多方面探索，本文將就HIF-1α在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的作用及中醫(yī)藥在該領(lǐng)域研究進(jìn)展作一綜述。

1 HIF-1α概述

子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血進(jìn)入腹腔時，必然要經(jīng)歷缺血、缺氧的改變。為了適應(yīng)低氧環(huán)境，細(xì)胞通過調(diào)劑上百種蛋白編碼基因表達(dá)，創(chuàng)造出了精妙而復(fù)雜的適應(yīng)機(jī)制，如改變糖代謝，細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲，血管生成等[12]。缺氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞應(yīng)對缺氧環(huán)境最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，其中HIF-1最具代表性，幾乎表達(dá)于各種細(xì)胞。HIF-1是由α、β兩個亞基形成異二聚體結(jié)構(gòu)，可以激活近百種靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞在缺氧應(yīng)激下的生物學(xué)行為。其中β亞基不受氧環(huán)境影響而穩(wěn)定表達(dá)；α亞基在常氧環(huán)境中被泛素蛋白酶體迅速降解，在低氧環(huán)境中才能穩(wěn)定表達(dá)。因此HIF-1的活性主要依賴于α亞基。低氧條件下，穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β形成二聚體，結(jié)合于靶基因啟動子區(qū)的缺氧反應(yīng)元件（Hypoxia response element，HRE），形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14]。

2 異位病灶中的HIF-1α表達(dá)

在子宮內(nèi)膜的周期性變化中，子宮內(nèi)膜功能層中HIF-1α的表達(dá)于分泌期逐漸增加，并在月經(jīng)期達(dá)到高峰[8]。一項(xiàng)基于卵巢型及腹膜型內(nèi)異癥的研究表明，異位內(nèi)膜組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)明顯高于正常人的子宮內(nèi)膜組織，異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α的基因表達(dá)是正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的2～3倍[15]。另有多項(xiàng)研究得到了與上述研究一致的結(jié)論[16-18]。值得注意的是，其中一項(xiàng)研究比較了深部浸潤型內(nèi)異癥組織與正常子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)前者HIF-1α的基因表達(dá)并未上調(diào)[17]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，III/IV期EMs患者血漿中HIF-1α水平顯著高于I/II期EMs患者，認(rèn)為HIF-1α可能可以作為預(yù)測EMs嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一[19]。雖然存在個別研究結(jié)果不一致的問題，但大多數(shù)研究認(rèn)為HIF-1α在EMs組織標(biāo)本或異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本中呈現(xiàn)高表達(dá)。因此，HIF-1α在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用也被越來越多的學(xué)者所重視。

3 HIF-1α對EMs發(fā)生發(fā)展的影響

3.1 HIF-1α影響細(xì)胞增殖、凋亡 HIF-1α能夠通過激活或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。缺氧條件下，內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)較常氧對照組明顯上調(diào)[20]。HIF-1α抑制劑棘霉素（echinomycin）能夠有效抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖[21]，可能與HIF-1α激活瘦素轉(zhuǎn)錄有關(guān)。缺氧預(yù)處理的在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，HIF-1α結(jié)合于瘦素啟動子區(qū)，參與啟動瘦素轉(zhuǎn)錄，使瘦素表達(dá)上調(diào)，瘦素高表達(dá)能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。此外，在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，HIF-1α能夠結(jié)合于miR20a的啟動子區(qū)，激活miR20a轉(zhuǎn)錄。HIF-1α和miR20a均能夠抑制雙特異性磷酸酶2（dual-specificityphosphatase-2，DUSP2，）的基因和蛋白表達(dá)，后者特異性抑制ERK磷酸酶活性，也就是說HIF-1α和miR20a的高表達(dá)可以通過下調(diào)DUSP2表達(dá)，間接延長ERK的活性[11]。在此基礎(chǔ)上，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）通過ERK通路上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9） 表達(dá)，從而促進(jìn)異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖[22]。

相較于正常人的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，EMS患者的在位內(nèi)膜在缺氧環(huán)境中的凋亡率明顯降低[20]。一項(xiàng)基于卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫細(xì)胞系CRL-7566的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后，miR-210表達(dá)上調(diào)，miR-210的過表達(dá)抑制了caspase-3活化，進(jìn)而抑制了缺氧所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[23]。在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，DUSP2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致IL-6產(chǎn)生增加，IL-6進(jìn)一步誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)錄及激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3） 磷酸化，能夠減少caspase-3的切割活化，從而抑制細(xì)胞凋亡[24]。HIF-1α抑制劑棘霉素能夠通過減少抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]，也間接說明HIF-1α高表達(dá)能夠發(fā)揮抑制凋亡的作用。此外，缺氧環(huán)境依靠HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和異位內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生自噬，以維持內(nèi)膜組織的相對穩(wěn)定[18，23]。3.2 HIF-1α促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲 根據(jù)異位內(nèi)膜組織細(xì)胞來源于在位內(nèi)膜的種植學(xué)說，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、侵襲是其發(fā)生異位種植的前提。研究證實(shí)，在缺氧條件下，內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)，利用SiRNA轉(zhuǎn)染沉默HIF-1α表達(dá)可明顯減弱細(xì)胞的遷移、侵襲能力；此外，該研究應(yīng)用自噬抑制劑也能夠逆轉(zhuǎn)由缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移及侵襲，說明這一過程與自噬密切相關(guān)，但缺氧、自噬、遷移侵襲三者間的具體作用機(jī)制尚未明確[18]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs） 是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，有利于異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞突破腹膜保護(hù)開始異位生長[25]。在缺氧條件下，β-鏈蛋白 （β-catenin）表達(dá)上調(diào)，β-catenin/T-細(xì)胞因子 （T cell factor，TCF）通路被激活，從而促進(jìn)下游基因MMP-9的表達(dá)，敲除HIF-1α或β-catenin能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲[10]。此外，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞獲得遷移侵襲能力的重要原因。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞連接，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的過程，是腫瘤侵襲生長和轉(zhuǎn)移中的研究熱點(diǎn)問題，同時被認(rèn)為與子宮內(nèi)膜異位種植密切相關(guān)[26-27]。人類子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)下，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）表達(dá)下降，Snail家族鋅指蛋白1、β-catenin及多種間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)，說明細(xì)胞發(fā)生了EMT改變；敲除HIF-1α后，明顯減弱了由缺氧誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞的侵襲能力[28]。以上研究說明，缺氧條件下，HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)能夠提高異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

3.3 HIF-1α促進(jìn)血管生成 盡管內(nèi)異癥的病因機(jī)制不清，但負(fù)責(zé)氧及營養(yǎng)供應(yīng)的新血管形成是其中必不可少的環(huán)節(jié)，因此血管生成是內(nèi)異癥重要的研究領(lǐng)域，同時也是內(nèi)異癥治療藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[29]。血管生成由多種基因調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要也是研究最多的一種基因。HIF-1可結(jié)合于VEGF基因啟動子區(qū)的HRE，直接激活VEGF轉(zhuǎn)錄[30]。此外，在缺氧的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，IL-8基因表達(dá)上調(diào)，IL-8受體抑制劑reparixin能夠抑制由缺氧引起的血管生成，說明IL-8也是缺氧誘導(dǎo)血管生成中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[31]。HIF-1α活化β-catenin/TCF通路可以增強(qiáng)VEGF基因表達(dá)[10]。HIF-1α間接延長ERK的活性，ERK的持續(xù)活化能夠促進(jìn)一系列血管生成因子表達(dá)[11]。說明HIF-1α具有影響其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間接促進(jìn)血管生成相關(guān)基因表達(dá)的作用。

3.4 HIF-1α促進(jìn)炎癥發(fā)生 內(nèi)異癥因其表現(xiàn)為腹膜免疫細(xì)胞活化及促炎介質(zhì)增多，被認(rèn)為是一種慢性盆腔炎癥疾病。前列腺素作為主要的促炎介質(zhì)，也參與了內(nèi)異癥病變的發(fā)展過程[32]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素的重要催化酶，COX-2在異位內(nèi)膜中的表達(dá)遠(yuǎn)高于在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜。缺氧條件下，子宮內(nèi)膜細(xì)胞中COX-2基因表達(dá)上調(diào)，主要的機(jī)制可能是HIF-1激活了孤兒核受體小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP） 轉(zhuǎn)錄，SHP轉(zhuǎn)活化了尾側(cè)相關(guān)轉(zhuǎn) 錄 因 子 1（Caudal-related transcription factor 1，CDX1），CDX1表達(dá)抑制將直接影響COX-2的轉(zhuǎn)錄活性，即HIF-1α通過SHP、CDX1的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)間接促進(jìn)了COX-2表達(dá)[33]。此外，HIF-1α抑制DUSP2表達(dá)，延長了ERK活化時間，也能間接促進(jìn)COX-2的表達(dá)[34]。通過以上機(jī)制，HIF-1α能夠間接促進(jìn)前列腺素合適，誘導(dǎo)并維持異位病灶炎癥狀態(tài)。

3.5 HIF-1α影響雌激素受體表達(dá) 異位病灶局部呈現(xiàn)與月經(jīng)周期無關(guān)的高雌狀態(tài)，與異位病灶的生長密切相關(guān)。雌激素與雌激素受體結(jié)合后，通過激活靶基因轉(zhuǎn)錄或其他非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，發(fā)揮生物學(xué)作用[35]。主要的雌激素受體有兩種，雌激素受體α（estrogen receptor-alpha，ERα） 和雌激素受體β （estrogen receptor-beta，ERβ），由獨(dú)立的基因編碼。兩種受體在時間、空間分布及生理表達(dá)上截然不同。在異位內(nèi)膜組織及異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，ERβ的表達(dá)遠(yuǎn)高于ERα，且超過在位內(nèi)膜ERβ表達(dá)量的100倍以上[36]。過高的ERβ表達(dá)在內(nèi)異癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。研究證實(shí)，在缺氧條件中，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中ERβ表達(dá)上調(diào)，當(dāng)HIF-1α基因被抑制時，ERβ表達(dá)下調(diào)[37]，說明HIF-1α起著調(diào)控ERβ表達(dá)的重要作用。

4 中醫(yī)藥研究進(jìn)展

桂枝茯苓丸是中醫(yī)婦科治療癥瘕的基本方。萬貴平[38]和崔明華[39]均采用大鼠自體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型研究證實(shí)，經(jīng)桂枝茯苓丸治療后，異位病灶中HIF-α基因及蛋白表達(dá)下調(diào)。補(bǔ)腎溫陽化瘀方由制附片、肉桂、延胡索、小茴香、川芎、桑寄生、制沒藥、黨參、炒白術(shù)、川楝子及川牛膝組成。賈云波[40]和袁小琴[41]通過自體移植構(gòu)建大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，經(jīng)補(bǔ)腎溫陽化瘀方治療后異位病灶體積明顯縮小，且HIF-1α的基因、蛋白表達(dá)下降。此外賈云波等的研究還證實(shí)補(bǔ)腎溫陽化瘀方還能夠上調(diào)脯氨酸羥化酶2（proline hydroxylase 2， PHD2） 及希佩爾-林道抑癌基因 （von Hipel lindau disease，VHL）。在常氧條件下，PHD2促進(jìn)HIF-1α羥基化，羥基化的HIF-1α與磷酸化的VHL相結(jié)合，更容易被蛋白酶降解。因此，PHD2、VHL的表達(dá)與HIF-1α呈負(fù)相關(guān)。研究認(rèn)為補(bǔ)腎溫陽化瘀方可能通過上調(diào)PHD2及VHL表達(dá)促進(jìn)了HIF-1α的降解。

5 小結(jié)

缺氧及HIF-1α通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)血管生成，維持炎癥環(huán)境，改變雌激素生物效應(yīng)等多方面，促進(jìn)了異位病灶的形成及進(jìn)展。以HIF-1α為靶標(biāo)的治療藥物如羅米地辛（romidepsin）[42]、棘霉素 （echinomycin）[21]、2-甲氧雌二醇[43]已開展了一系列的體內(nèi)體外研究。隨著對HIF-1α研究的逐漸完善，HIF-1α在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的復(fù)雜作用必將被揭示，HIF-1α將成為治療內(nèi)異癥的有力靶點(diǎn)。相對于西藥研究的逐漸深入，中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制研究仍多停留在“證明性發(fā)現(xiàn)”層面，缺乏關(guān)聯(lián)性深層次研究，未能充分體現(xiàn)出中藥“多組分靶點(diǎn)”的治療優(yōu)勢。中藥復(fù)方研究證實(shí)，中藥治療后，異位病灶中HIF-1α基因、蛋白表達(dá)減少，是否與活血化瘀藥物改善了病灶局部的微循環(huán)有關(guān)呢？哈佛大學(xué)Jain教授在腫瘤的治療中提出了血管正常化（vascular normalization）假說，即合理地運(yùn)用抗血管生成藥物，并非意在摧毀腫瘤血管，而是修復(fù)異常的血管系統(tǒng)，使其趨于正常，進(jìn)而使腫瘤組織微環(huán)境趨于正常，提高其對治療的敏感性[44]。那么，在EMs的治療中，我們是否也可以應(yīng)用這樣的假說思考治療策略呢？活血化瘀藥物對于HIF-1α的調(diào)控是不是藥物對于病灶缺氧環(huán)境改善的反應(yīng)呢？對這一問題的思考也許能夠成為今后研究中藥復(fù)方治療內(nèi)異癥的有力切入點(diǎn)。

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