微生物學

秦楠，栗東芳，楊瑞馥

高通量測序技術(shù)及其在微生物學研究中的應(yīng)用

秦楠，栗東芳，楊瑞馥

20世紀70年代，由Frederick Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法核酸測序技術(shù)，為科學發(fā)展做出了重要貢獻，成就了人類基因組的完成。Sanger測序法也被稱為第一代測序技術(shù)，它的原理是以 DNA單鏈為模板，進行 PCR擴增，擴增體系中加入的堿基為 dNTP和熒光ddNTP，對得到的不同長度產(chǎn)物進行電泳分離和激光誘導熒光顏色區(qū)分，經(jīng)過信息轉(zhuǎn)換，獲得長達 800 bp的DNA鏈堿基組成序列。該方法已經(jīng)在PCR產(chǎn)物、載體克隆測序等方面得到廣泛應(yīng)用，但其成本高和測序通量低的缺陷，限制了該方法在大規(guī)模測序中的應(yīng)用。新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology，或被稱為第二代測序技術(shù)）以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技術(shù)為代表。這些測序平臺以數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高為最大特點，以Solexa技術(shù)為例，采用了該技術(shù)的Hiseq 2000測序儀，一臺機器在兩周內(nèi)就可以產(chǎn)出超過300 G的數(shù)據(jù)，相當于把人類基因組重復測 100遍以上。這完全改變了過去的研究模式，給人類和動植物基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、宏基因組學研究等方面帶來全新的變化，并逐步深入到微生物學研究領(lǐng)域中。本綜述旨在介紹代表性的高通量測序技術(shù)，同時著重闡述該技術(shù)在微生物學研究中的應(yīng)用。高通量測序技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，使得核酸序列的測定速度與成本價格的比值，以超過摩爾定律的速度迅速增加。因此，全基因組（轉(zhuǎn)錄組）序列測序技術(shù)將不可避免地像PCR技術(shù)那樣，走入每一個分子生物學實驗室，成為微生物學家們的常規(guī)研究手段。而高通量測序技術(shù)所帶來的基因組學和轉(zhuǎn)錄組學研究的變革，會為蛋白質(zhì)組學 和代謝組學奠定基礎(chǔ)，它們將共同成為系統(tǒng)微生物學發(fā)展的基石。但問題和挑戰(zhàn)依然存在。首先，隨著核酸序列數(shù)量上的跨越式累積，生物信息學分析將面臨巨大的挑戰(zhàn)，適用于常規(guī)實驗室使用的新統(tǒng)計學方法和分析軟件的開發(fā)成為當前的迫切需求。另外，海量數(shù)據(jù)的深入挖掘工作會發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)生物學理論難以解釋的生命規(guī)律，對傳統(tǒng)理論的顛覆和新理論的提出與建立將成為不可避免的工作。

來源出版物：微生物學報, 2011, 51(4): 445-457

入選年份：2015

我國禽流感研究進展及成就

張毅，王幼明，王芳，等

摘要：禽流感不僅嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)，而且給公共衛(wèi)生造成巨大威脅。為了科學認識和積極防控禽流感，我國科學家進行了大量且富有成效的研究，取得了舉世矚目的成果。1996年，中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所從廣東一個鵝場分離到 H5N1亞型禽流感病毒，命名為A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），這是我國第一次分離到高致病性禽流感病毒。流行病學調(diào)查分析表明，近些年來在我國的雞群中流行的H5N1亞型禽流感病毒主要屬于 Clade2.3.2、Clade2.3.4和 Clade7。1994年陳伯倫等人首次從我國廣東某雞場發(fā)病雞體內(nèi)分離到 H9N2亞型病毒，目前我國大陸地區(qū)的雞群中主要流行Y280-like和G1-like兩個分支的H9N2亞型禽流感病毒。通過長期的監(jiān)測，基本掌握了禽流感在我國的流行情況和進化規(guī)律。利用反向遺傳和定點突變操作技術(shù)，已證實H5N1亞型禽流感病毒PB2蛋白D701N的突變，HA蛋白裂解位點P6位絲氨酸的突變，NS1蛋白P42S的突

變均與病毒對哺乳動物的致病力增強有關(guān)。Shi等首次解析了 H7N9病毒的 HA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并解釋了H7N9病毒為何會感染人類及HA蛋白226位在結(jié)合人類上呼吸道α-2，6唾液酸受體中所起的作用。利用先進的生物技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了影響流感病毒致病力、傳播力和受體結(jié)合能力的部分關(guān)鍵位點，闡釋了其作用機制。目前我國已建立了成熟的H5、H7、H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR的國家檢測標準，LAMP-PCR等改進的PCR方法也已應(yīng)用于禽流感的檢測，Han等利用 DNA芯片技術(shù)，設(shè)計針對16種不同HA亞型和9種不同NA亞型的核酸探針，可以一次性快速鑒別出分離到病毒屬于何種亞型。通過對傳統(tǒng)技術(shù)的改進和先進方法的應(yīng)用，不斷成功建立禽流感診斷、檢測技術(shù)。Liu等以鴨腸炎病毒為載體構(gòu)建了 H5亞型病毒的活載體疫苗，F(xiàn)an等利用反向遺傳操作技術(shù)，構(gòu)建了H5N1病毒減毒冷適應(yīng)活疫苗。新型禽流感疫苗不斷涌現(xiàn)并逐步被推廣和應(yīng)用，取得了良好的免疫效果。上述成果為我國禽流感的防控奠定了良好的基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究提供了依據(jù)。但是禽流感的防控形勢依然嚴峻，新型H7N9病毒的出現(xiàn)，使禽流感的防控面臨新的挑戰(zhàn)。

來源出版物：微生物學通報, 2014, 41(3): 497-503

入選年份：2015