月經(jīng)血鑒別方法的法醫(yī)學研究進展

李 軍 宮春妮 巢 雯

（中國刑事警察學院法醫(yī)學系 遼寧 沈陽 110035）

1 引言

在法醫(yī)學實踐中，生物組織來源往往可提示案件發(fā)生的過程及重建現(xiàn)場，例如死者指甲檢出非本人人體組織成分，推測死者生前曾與他人發(fā)生過肢體接觸，從而給偵查工作提供線索。因此，有時需要對生物檢材的組織來源進行確認，月經(jīng)血是其中一種重要檢材。例如在傷害案中，女性受害者稱因受暴力攻擊出現(xiàn)血尿，在這種情況下，需要確定尿液中的血細胞來源是否存在月經(jīng)血污染，并結合其他臨床檢驗，審慎評定傷情。月經(jīng)血是女性的子宮內膜發(fā)生周期性脫落伴隨的出血[1]，與正常的外周血相比，月經(jīng)血在組成成分上有很大不同。目前實踐中對月經(jīng)血的檢測主要采用不同方法，針對其中的特異性成分進行鑒別。

2 經(jīng)典鑒定方法

目前，常用且成熟的方法可以分為兩類：一類是細胞形態(tài)學觀察法；另一類是特異生物大分子檢測法。

2.1 細胞形態(tài)學觀察法

月經(jīng)血是由血液和一些脫落的子宮內膜、陰道分泌物等組成的混合物。細胞形態(tài)學觀察法是指經(jīng)過特殊染色，在顯微鏡下找到子宮內膜細胞、陰道或宮頸鱗狀上皮細胞[2]。這種方法存在一定的不足之處：一方面，女性生殖器官出血也可見這些細胞，形態(tài)學觀察法僅能確定該血液來自于女性生殖器，而不能斷定其為月經(jīng)血；另一方面，該方法需要大量新鮮的血液涂片才有可能觀察到上述細胞，實際案件中的血痕量難以滿足觀察要求，故實際應用效果不佳。

2.2 特異性生物大分子檢測法

月經(jīng)血之所以不易凝固是因為其中的纖維蛋白被纖溶酶降解，已有研究者對月經(jīng)血中的纖溶蛋白降解產(chǎn)物進行檢驗。19世紀60、70年代，Kamimura[3]將纖維蛋白加入到血痕提取液中，再用紙電泳檢查其分解產(chǎn)物。Whitehead[4]通過變性纖維蛋白混濁試驗或抗人纖維蛋白原沉淀試驗，用免疫電泳方法區(qū)分月經(jīng)血和其他部位出血。這些方法雖然在喪失溶解纖維蛋白能力的情況下仍可進行鑒定，但是無法將月經(jīng)血與分娩血、流產(chǎn)血、流動的尸血，以及某些患有與纖維蛋白溶解相關疾病的血液相區(qū)別。Asano[5]對乳酸脫氫酶（LDH）的同工酶進行測定，其原理是電泳時5種LDH分子的遷移程度不同，形成5個明顯的區(qū)帶，正常血中LDH同工酶組成比例接近于其在紅細胞中的比例，即LDH4、LDH5含量幾乎為0，而在月經(jīng)血中LDH4、LDH5含量增多，兩者總和尤為明顯，據(jù)此形成LDH同工酶圖譜，可以區(qū)分月經(jīng)血與其他體液成分。隨后Divall[6]，Miyaishi[7]等對LDH在月經(jīng)血鑒別中的作用做進一步研究，發(fā)現(xiàn)LDH無法用于區(qū)分經(jīng)血與外周血、陰道分泌物的混合血樣本。目前，隨著犯罪技術的提高，現(xiàn)場留下的血跡逐漸變得量小體微，取得的檢材難以進行上述檢驗；另外，由于以上檢驗方法和技術的靈敏度、專一性等難以適應現(xiàn)在的鑒定要求，該方法逐漸被新興檢測方法所取代。

3 新興鑒定方法

3.1 基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）鑒定法

隨著研究技術的發(fā)展進步，法醫(yī)學者開始著眼尋找新的檢測標志物。經(jīng)研究證實，多種MMP分子參與月經(jīng)周期的相關過程，因此，MMP成為熱門研究對象。經(jīng)學者研究發(fā)現(xiàn)，MMPs中的部分成員可以作為月經(jīng)血的特異性標記使用，其中同時符合靈敏度高、專一性好的是MMP7和MMP11。MMP7主要與子宮內膜的增生重建過程有關[8]。MMP11也是以上行為的重要參與執(zhí)行者，尤其在增生期、分泌晚期、月經(jīng)期子宮內膜中的活躍度高[9-10]。MMP7、MMP11作為月經(jīng)周期的重要參與者，已被用來進行月經(jīng)血的鑒別。

3.2 RNA分析技術在月經(jīng)血鑒別中的應用

經(jīng)典鑒別方法局限性較大，法醫(yī)學者開始探索新的檢驗技術。RNA是細胞內DNA與蛋白質的連接橋梁。RNA主要分為4種，目前將其用于法醫(yī)學研究較深入的是mRNA（messenger RNA）和miRNA（micro-RNA）。由于mRNA具有表達特異性，因此，用于檢測RNA的種類可以回溯其組織來源[11]。逆轉錄PCR（RT-PCR）法、實時定量PCR（qRTPCR）法成為目前檢測月經(jīng)血中特異性的mRNA、miRNA的主流技術，已取得的實驗成果頗多。

3.2.1 mRNA檢測技術

mRNA在干燥載體上有較高的穩(wěn)定性，可以與DNA從同一樣本中同時提取，而且在一次多重反應中能夠檢測多種體液成分，是良好的檢測標志物。Juusola和Ballantyne[12]開始致力于尋找特異性基因以定位體液和組織來源的方法。2005年Juusola和Ballantyne[13]設計實驗體系，得到了一種鑒別體液的復合RT-PCR方法，體系中包括八個特異性基因（SPTB、PBGD、STATH、HTN3、PRM1、PRM2、HBD1和MUC4），用來鑒別血液、唾液、精液、陰道分泌物。該體系可以進行混合斑的檢測，檢測量可低至200pg總RNA模板。2007年Juusola和Ballantyne[14]在先前檢測體系基礎上進行重新設計，ALAS2取代PBGD，MMP7和MMP10成為月經(jīng)血的檢測標記被納入體系中，初次將mRNA檢測應用于月經(jīng)血的鑒別。同年Bauer[15]經(jīng)過實驗證實mRNA檢測未檢出MMP7的體液可以確定不是月經(jīng)血。Haas[16-18]在先前mRNA標記體系的基礎上，重新選擇標記物，包括用來鑒定月經(jīng)血的MMP7和MMP11在內的11種標記物，構建復合RT-PCR體系和qRTPCR體系來鑒定月經(jīng)血等5種體液來源，這兩個復合體系均顯示出高特異性和高靈敏度。另外，對于MMP7、MMP11的靈敏度和專一性，學者進行過分析討論，Haas、Lindenbergh、Xu Y[19-20]等研究者認為MMP7的靈敏度高于MMP11，而MMP11的專一性更高；相反，Richard、JaKubowska[21-22]等認為，MMP11是判定月經(jīng)血更佳的指標。Haas[23]進一步研究，嘗試在復合體系中加入MSX1、LEFTY2和SFRP4三個新的檢測標記，增加了檢測體系的可信度。

3.2.2 miRNA檢測技術

miRNAs屬于一類具有內源調控作用的非編碼小RNA，參與多途徑的調控過程，miRNAs的表達具有組織特異性。

Hanson[24]于2009年首次發(fā)表了關于miRNA用于組織來源鑒別的研究成果。經(jīng)過試驗探索，運從月經(jīng)血等5種人體體液中選擇了452種人體miRNAs，最終確定9種不同miRNAs構成復合檢測體系：miR451、miR16、miR135b、miR10b、miR658、miR205、miR124a、miR372和miR412，其中miR451和miR412被認為是具有鑒別月經(jīng)血價值的miRNA，該方法檢測閾值可達到50pg，成為miRNA檢測月經(jīng)血的開端。2013年，Zubakov[25]利用TaqMan的RT-PCR技術和Northern印跡技術從718個miRNA中選取9個研究它們的表達情況，檢測靈敏度達到0.1pg總RNA量，經(jīng)驗證，實驗所選取的miR185*和miR144特異性不高，不建議將其用于月經(jīng)血的鑒別。同年，Wang[26]進行進一步研究，利用qPCR測定法（TaqMan1 Array Human MicroRNA Cards）篩選754個miRNA進行檢測，研究結果顯示miR214在月經(jīng)血的鑒定中特異性較好。2014年，Hanson[27]在先前的實驗基礎上進行深入探索，新增加746個miRNA，測定總miRNA數(shù)目達到1198個，構建二元邏輯回歸模型得出關于月經(jīng)血的定量統(tǒng)計模型。二維散點圖研究以qPCR為基礎測量ΔCt值（選擇管家基因miR940作為標準參考，設定ΔCt參數(shù)，ΔCt = Ct（MBmiRNA-CtmiR940），ΔCt值在二維散點圖上的聚集狀況反映不同樣本的種類）。經(jīng)過檢驗測算確定了miR144-5p、miR144-3p和miR185-5p在月經(jīng)血鑒定中具有高度專一性和敏感度，并表明主要影響因素miR185和三因素（miR144-5p、miR144-3p、miR185-5p）相互作用綜合分析對預測月經(jīng)血十分有效。二元邏輯回歸模型增加了鑒別體液組織來源的準確度，效果優(yōu)于二維散點圖。Li[28]在2015年的研究中確定miR141-3p可以用于月經(jīng)血的鑒定?？梢钥吹?，基于技術平臺和統(tǒng)計學分析方法的差異，眾多學者的研究結果并不一致，可信度不高。目前為止，對miRNA用于月經(jīng)血鑒別的研究仍在探索階段，仍需要進行更多深入的實驗研究。

3.3 其他方法

除了主流的RNA檢測技術外，對于月經(jīng)血的鑒別仍有許多學者進行了各種實驗研究。

3.3.1 免疫化學方法

有研究表明，月經(jīng)血D-二聚體是外周血中的2000倍[29]，因此，Baker[30]提出檢測月經(jīng)血中的D-二聚體的濃度以鑒定月經(jīng)血與外周血。我國研究者對MMP11的研究，還有其他方法：姚亞楠[31]運用鏈霉卵白素-堿性磷酸酶免疫組化法檢測MMP11；章雅清[32]運用免疫印跡法轉膜、增強化學發(fā)光法顯色檢測 MMP11，兩種方法陽性率均較高。Gray[33]使用免疫細胞化學染色法分析細胞或膜結合的抗原，通過間接ELISA法檢測可溶性抗原，結果在月經(jīng)血中檢測到MMP14，而外周血中未檢見。免疫化學方法雖然在操作上繁瑣，但已經(jīng)較為成熟，可為月經(jīng)血鑒別提供參考。

3.3.2 DNA甲基化方法

Song[34]等學者經(jīng)過大量研究證實，組織特異性差異甲基化區(qū)（tDMRs）存在于多種哺乳動物的不同組織中，有學者開始研究DNA甲基化標記能否用來進行月經(jīng)血的鑒別檢測。但由于月經(jīng)血是含有外周血、脫落的子宮內膜組織、陰道分泌物，以及陰道菌群等的混合物，各種因素對甲基化干擾較大，因此，通過DNA甲基化進行月經(jīng)血鑒別比較困難。2016年Forat[35]首次報道了位于SLC26A10基因上的cg09696411可以用來鑒別月經(jīng)血。同年Hwan Young Lee[36]使用Human Methylation 450 Bead Chip array確定位于SLC26A10基因上的cg09696411和cg18069290是良好的鑒定月經(jīng)血的甲基化標記，其中cg09696411在月經(jīng)周期的第2天含量最高。但同時也指出該標記的特異性程度與月經(jīng)周期時間段和月經(jīng)血收集方法有關。已知DNA甲基化程度與年齡有關，因此，甲基化能否有效的鑒別月經(jīng)血，還需要排除其他干擾因素，設計更多的實驗進行探索。

3.3.3 高分辨率熔解法

高分辨率熔解法（High Resolution Melt analysis，HRM）利用特定染料可以插入DNA雙鏈小溝中（PCR產(chǎn)物）的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA解鏈，熒光染料脫落，熒光信號減弱或消失的過程，高分辨記錄熔解曲線，不同形狀熔解曲線將PCR產(chǎn)物中存在的差異直觀地展示出來，從而區(qū)分不同產(chǎn)物。Hanson[37]使用HRM技術，構建多重檢測體系對體液來源進行鑒別，其中用于鑒別月經(jīng)血的標記是MMP10，得到MMP10的Tm值為81.9℃。相比RNA分析法，HRM具有分析速度快的優(yōu)勢，可為月經(jīng)血的鑒別提供參考。

3.3.4 光譜分析法

由于不同物質分子的不同振動能級，因此，不同物質的拉曼光譜具有特異性，可以反映分物質的組成信息[38]。2012年，Sikirzhytskaya[39]運用拉曼光譜分析法，使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和支持向量機判別分析（SVM-DA）建立判別模型，該模型對月經(jīng)血與外周血鑒別的靈敏度和選擇性可達98%，消除非特定光譜數(shù)據(jù)的干擾能夠將識別率提高到100%。

2015年高野[40]利用紫外可見分光光度計法建立了可以快速無損定性不同種類、不同情況的血跡的方法，該方法根據(jù)檢測得到特定的波峰波谷可以確定不同血跡的種類。實驗中檢測得到月經(jīng)血的波峰為560nm、波谷為575nm，具有特異性。

衰減全反射傅立葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）逐漸開始被學者用于液體斑跡鑒定的研究。ATR-FTIR基于光內反射原理，收集樣品表面的紅外光反射信號來反映樣品表層的結構信息[41]。2017年Quinn[42]利用ATR-FTIR技術檢測到在1039cm-1處月經(jīng)血與外周血發(fā)生峰分離，這與月經(jīng)期女性體內游離的磷酸釋放有關。ATR-FTIR具有非破壞性、制樣簡單的優(yōu)點。

以上光譜法在測定月經(jīng)血上具有不破壞檢材的優(yōu)點，但是現(xiàn)場檢材復雜程度高，光譜能否發(fā)揮功效仍有待進一步驗證。

4 展望

部分月經(jīng)血檢測方法已進入應用階段，但多數(shù)檢測方法仍處在研究階段，在法醫(yī)實踐中仍缺乏靈敏快速的檢測方法。因此，我們仍需要對以上方法進行優(yōu)化和探索，同時開展新的研究，以求獲得一種方便、高效、快速，可用于現(xiàn)場即時檢驗的方法。

經(jīng)典鑒定方法為月經(jīng)血檢測的研究奠定了基礎，但其所采用的方法繁瑣、靈敏度低，因而難以適應現(xiàn)今的研究和應用。新興鑒定方法采用新的標志物MMP及新的鑒定技術，極大提高了月經(jīng)血鑒定的準確性。其中研究較為深入的是RNA檢測技術，選取MMP7、MMP10、MMP11作為檢測標志物均得到可靠的結果，可為法醫(yī)實踐提供參考。此外免疫化學方法已較為成熟，但操作較繁瑣；DNA甲基化方法尚需更多實驗排除其他因素干擾；高分辨率熔解法和光譜分析法在實驗室分析得到的結果特異性較好，但無法用于現(xiàn)場快速檢驗。

隨著技術的提升與研究的深入，相信月經(jīng)血在法醫(yī)現(xiàn)場檢測應用方面的研究能夠不斷取得新的進展，例如根據(jù)免疫化學方法，設計金標試紙條對現(xiàn)場疑似月經(jīng)血的血跡進行快速檢測，這將有助于提高偵查破案速度，并在一定程度上推動法醫(yī)實踐的發(fā)展。

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