夏蠟梅體外植株再生體系的建立

曹艷春+趙振利

摘要：以夏蠟梅幼嫩葉片為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究建立其體外植株再生體系。結(jié)果表明，夏蠟梅葉片愈傷組織、芽、根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基分別為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA，這為夏蠟梅的快速繁殖及工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：夏蠟梅；體外植株；培養(yǎng)基；再生；愈傷組織

中圖分類號(hào)： S685.990.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0039-02

夏蠟梅（Calycanthus chinensis Cheng et S. Y. Chang）為蠟梅科夏蠟梅屬落葉灌木，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，其花形奇特、色彩淡雅，觀賞價(jià)值高，是一種在園林綠地中常用的花灌木。夏蠟梅初開之花有解暑、清熱、理氣、止咳等功效，花、根可治胃痛，葉含有揮發(fā)性的芳香油，因此，夏蠟梅具有廣闊的開發(fā)利用前景。目前，生產(chǎn)上夏蠟梅主要靠種子繁殖，由于其繁殖率低、育苗周期長(zhǎng)，根本滿足不了生產(chǎn)和科研需要，而國(guó)內(nèi)外對(duì)夏蠟梅的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)器官解剖、逆境脅迫對(duì)幼苗生理生態(tài)特性的影響等[1-4]，利用莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究相對(duì)較少[5-6]，且存在繁殖系數(shù)低、組培系統(tǒng)不完善等問題。本研究利用夏蠟梅幼苗葉片，通過篩選其組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、水平及使用比例，建立其高效的體外植株再生體系，為其新品種培育、分子生物學(xué)研究和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2年生夏蠟梅健康植株，由河南省中牟縣白沙鎮(zhèn)蠟梅資源圃提供，取其幼嫩葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立體外植株再生體系。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1夏蠟梅外植體的預(yù)培養(yǎng)將采集的夏蠟梅幼嫩葉片用75%乙醇（酒精）消毒30 s，無(wú)菌水清洗3次；用0.1%氯化汞消毒5 min，用無(wú)菌水清洗3次；接種于含有植物激素的MS基本培養(yǎng)基（含蔗糖20 g/L、瓊脂粉4.6 g/L）上，在溫度為 25±2 ℃、光照強(qiáng)度為130 μmol/（m2·s）、光照時(shí)間為16 h/d的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。組織培養(yǎng)條件下同。

1.2.2夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基（蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L、瓊脂粉質(zhì)量濃度為4.6 g/L、聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為1.5 g/L），分別添加濃度梯度為0.1、0.3、0.5、0.7、1.1 mg/L的萘乙酸（NAA）和濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/L的6-芐基腺嘌呤（6-6-BA，簡(jiǎn)稱6-BA）；將夏蠟梅預(yù)培養(yǎng)的葉片切成約1.0 cm×1.0 cm的小塊，接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，每組合20瓶，每瓶3個(gè)外植體；每隔10 d統(tǒng)計(jì)1次愈傷組織誘導(dǎo)率，第50天時(shí)根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率的大小確定葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。愈傷組織誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.3夏蠟梅芽的誘導(dǎo)將誘導(dǎo)產(chǎn)生的夏蠟梅愈傷組織，接種到MS添加不同濃度NAA、6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，NAA、6-BA濃度設(shè)置與愈傷組織誘導(dǎo)相同，培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每組合20瓶，每瓶3塊；第30天時(shí)觀察芽的分化情況，以誘導(dǎo)出的芽肉眼可清晰分辨為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算芽的誘導(dǎo)率，確定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。芽誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.4夏蠟梅根的誘導(dǎo)誘導(dǎo)出的芽長(zhǎng)到約3 cm高時(shí)，從莖基部剪下，轉(zhuǎn)接到添加濃度梯度為0.1、0.3、0.5 mg/L NAA的1/2 MS生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，觀察生根情況，第20天時(shí)統(tǒng)計(jì)其生根率，篩選出夏蠟梅根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。根誘導(dǎo)率=（生根的幼芽數(shù)/接種的幼芽總數(shù)）×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用LSR法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素組合對(duì)夏蠟梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可見，不同激素組合培養(yǎng)基對(duì)夏蠟梅葉片愈傷組織（圖1-A）的誘導(dǎo)差異明顯；NAA質(zhì)量濃度為0.1～1.1 mg/L 時(shí)，隨6-BA濃度的升高，夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸減小，其中，NAA質(zhì)量濃度為0.9～1.1 mg/L時(shí)，隨6-BA質(zhì)量濃度的升高，夏蠟梅葉片愈傷組織的褐化情況逐漸加重；培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA時(shí)，夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率相對(duì)最大，為100.00%，該培養(yǎng)基作為夏蠟梅葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

2.2不同激素組合對(duì)夏蠟梅芽誘導(dǎo)的影響

由表1可見，NAA質(zhì)量濃度為0.5～1.1 mg/L時(shí)，隨 6-BA 質(zhì)量濃度的升高，葉片芽誘導(dǎo)率逐漸減小，其中，培養(yǎng)基組合為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA時(shí)芽的誘導(dǎo)率相對(duì)最大，為59.67%，說明夏蠟梅愈傷組織芽誘導(dǎo)（圖1-B）的最適培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA。

2.3不同激素濃度對(duì)夏蠟梅根誘導(dǎo)的影響

由表2可見，夏蠟梅芽在沒有添加NAA的1/2MS培養(yǎng)基上也可誘導(dǎo)出根（圖1-C），生根率為100.00%，但誘導(dǎo)出根的條數(shù)相對(duì)較少，為3條；培養(yǎng)基1/2MS+0.3 mg/L NAA誘導(dǎo)出根的條數(shù)相對(duì)最多、根長(zhǎng)相對(duì)相對(duì)最長(zhǎng)，分別為6條、3.0 cm，并可形成完整植株（圖1-D），可作為夏蠟梅生根的最適培養(yǎng)基。

3結(jié)論與討論

植物體外植株再生與植物品種、基因型和培養(yǎng)條件密切相關(guān)。一般情況下，植物基因型在分類學(xué)中的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，體外植株再生體系所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度差異就越大[7-9]。前人用夏蠟梅莖段培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，莖段在培養(yǎng)過程中周圍培養(yǎng)基有變綠現(xiàn)象，可能為葉綠體的滲透，同時(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，莖段上皮孔增大，有粉末狀物質(zhì)溢出，影響芽的增殖和分化[5]。本研究以夏蠟梅幼嫩葉片為材料，在基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，篩選出愈傷組織、芽、根誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基組合分別為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度一致時(shí)，隨 6-BA 質(zhì)量濃度的升高，夏蠟梅愈傷組織的誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，這與張變莉等結(jié)論[10-11]吻合；加入NAA對(duì)根誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，能夠增加根的數(shù)量，提高根的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳模舜，柯世省. 瀕危植物夏蠟梅營(yíng)養(yǎng)器官的解剖結(jié)構(gòu)特征[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（3）：37-41.

[2]汪瓊，史云云，姚青菊，等. 夏蠟梅和美國(guó)蠟梅及屬間雜種“紅運(yùn)”營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)特征比較[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（3）：62-68.

[3]彭禮瓊，金則新，王強(qiáng). 模擬酸雨對(duì)瀕危物種夏蠟梅幼苗生理生態(tài)特性的影響[J]. 植物研究，2013，33（2）：202-207.

[4]朱琳，蘆建國(guó). 干旱脅迫對(duì)夏蠟梅幼苗生理特征的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，39（2）：179-182.

[5]邵果園，蔡榮榮，王力超，等. 夏蠟梅組織培養(yǎng)試驗(yàn)初報(bào)[J]. 浙江林業(yè)科技，2006，26（5）：28-30.

[6]顧福根，萬(wàn)志剛，孫丙耀，等. 夏蠟梅的離體培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2007，34（4）：324.

[7]Bergmann B A，Heungkyu M. In vitro adventitious shoot production in Paulownia[J]. Plant Cell Reports，1997，16（5）：315-319.

[8]Fan G Q，Zhai X Q，Zhai C J，et al. Callus induction from leaves of different Paulownia species and its plantlet regeneration[J]. Journal of Forestry Research，2001，12（4）：209-214.

[9]佘茂云，殷桂香，趙佩，等. 植物組織培養(yǎng)過程中器官發(fā)生途徑再生植株分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 科技導(dǎo)報(bào)，2015，33（2）：91-98.

[10]張變莉，王楊，劉榮寧，等. 同源四倍體臺(tái)灣泡桐體外植株再生系統(tǒng)的建立[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（7）：119-123.

[11]翟曉巧，聶琳，張曉申. 灰楸體外植株再生體系建立[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（3）：17-19.endprint