脂肪間充質(zhì)干細胞的研究進展

黃鄧高,曹 卉,高元慧,鄭琳麟,張淑芳

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院中心實驗室,?？?507208;*通訊作者,E-mail:haikuoyiyuan@163.com)

過去,脂肪只被看作是一種能量儲存的組織而未引起研究者們重視。直到20世紀80年代中期,確定其參與性激素的新陳代謝后,脂肪組織變成一個參與人體新陳代謝和免疫應(yīng)答重要的內(nèi)分泌器官[1]。2001年Zuk等[2]首次報道一種新成體干細胞的來源,脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ASCs)從脂肪組織分離獲得,并于2004年達成共識稱為“ASCs”[3]。此后,因其與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived stem cells,BMSCs)一樣具有高度增殖和自我更新能力,可在脂肪組織中分離獲得大量的ASCs,且能多向分化成為中胚層和非中胚層細胞[4],使其成為成體干細胞在再生醫(yī)學應(yīng)用研究的熱點。應(yīng)用于皮膚組織再生[5,6]、軟骨和骨組織再生[7-10]、傷口愈合[11]、肝臟組織再生[12,13]、腦組織修復(fù)[14]、心肌梗死修復(fù)[15]、肌肉組織修復(fù)[16]、3D培養(yǎng)[17,18]以及整形美容[19]等,為許多疾病提供治療方案,在修復(fù)、替換、維持或增強組織和器官的研究領(lǐng)域,凸顯了強大的再生醫(yī)學功能。

然而,從實驗室研究到臨床應(yīng)用對ASCs的研究仍然存在爭議,不同研究者們的結(jié)果報道不一致。尤其在ASCs的分離培養(yǎng)、細胞表面標志物、增殖通路、誘導腫瘤發(fā)生、作用機制以及臨床研究等方面。本文旨在對近年來ASCs研究進展進行綜述。

1 ASCs的分離培養(yǎng)

研究表明,ASCs的產(chǎn)量受年齡、采集的部位和分離方法的影響。目前,ASCs具有最佳生物學功能且獲取的細胞數(shù)量最多的分離方法尚未明確。Iyyanki等[20]研究報道從腹部直接切除且?guī)в须x心的Coleman’s技術(shù)分離比從側(cè)面或腋下獲取更多的基質(zhì)血管部分(stromal vascular fraction,SVF)細胞和ASCs。Bian等[21]報道,直接切除術(shù)和吸脂術(shù)獲得的ASCs在數(shù)量和成脂分化潛能之間沒有顯著性差異,但吸脂術(shù)獲得ASCs的活細胞百分率明顯高于通過直接切除術(shù)。捐贈者的年齡是影響ASCs產(chǎn)量的另一個重要因素,Wu等[22]研究顯示所有年齡組(嬰兒組、成人組和老人組)有相似的ASCs和成骨細胞的分泌活動。但從嬰兒獲得的ASCs血管生成和成骨能力比成年人和老年人高。Kornicka等[23]研究獲得較一致的結(jié)果:年輕人(≥20歲)組和老年人(50-70歲)組收獲ASCs在增殖活性、克隆-分化潛能和倍增方面有顯著性差異。

不同的實驗所建立的分離培養(yǎng)方法及標準化存在差異。Raposio等[24]使用兩種不同的方法:一種是基于機械+酶(ME)方法,另一種是專用機械法(MC),以確定哪一種更優(yōu)越。結(jié)果顯示,以相同的抽脂量,分離結(jié)果與MC(5%)相比,ME程序分離獲得ASCs更多(25.9%)。Markarian等[25]比較9種使用紅細胞裂解緩沖溶液、胰蛋白酶、膠原酶和離心的方法,分析了ASCs的分離速率、細胞活力、擴增速率、免疫表型和分化為脂肪和成骨細胞系的潛能,最后發(fā)現(xiàn)通過胰蛋白酶消化成功分離和培養(yǎng)的ASCs,細胞群呈現(xiàn)類似的免疫表型,可成脂分化和體外增殖,成骨分化能力比通過膠原酶分離的ASCs的高7倍。該替代方案比常用方法更有效且成本更低,可以作為用于獲得組織工程的ASCs相對有希望的方案?？傮w來說,膠原酶與胰蛋白酶消化法獲得的ASCs比較被大家認可。其他方法如以注射器為基礎(chǔ)的收獲方式、真空抽脂法和外科脂肪切除術(shù)等因具有一定的侵襲性和細胞受到一定的損傷而沒有被廣泛應(yīng)用。

雖然對脂肪組織的收獲程序有較一致意見,但目前沒有一個標準化的方案來分離ASCs用于臨床應(yīng)用,這導致了文獻中的不確定性。因此,需要一種以臨床應(yīng)用為目的的標準化方法,以優(yōu)化和統(tǒng)一整個組織操作的過程和分離程序。本課題組[26]運用微創(chuàng)技術(shù)獲取10-20 g腹部脂肪,采用Ⅰ型膠原酶法消化微量脂肪組織標本,成功培養(yǎng)出有效的人ASCs,細胞表面標志物CD90、CD105、CD73、CD44均表達陽性,而CD34、CD45、HLA-DR和IgG1均表達陰性,與之前報道的文獻[2,9,20]一致,連續(xù)培養(yǎng)10代以內(nèi)細胞表型與細胞形態(tài)無明顯變化。因此,隨著技術(shù)的進步,將來ASCs可能通過微創(chuàng)等技術(shù)而大量獲得,需要進一步探索。

2 ASCs細胞表面標志物

ASCs的一個顯著特點是它們不是同質(zhì)的群體。許多研究嘗試通過細胞表面標志物進行流式細胞術(shù)分析ASCs的表型,但是唯一的單一標記尚未被鑒定。ASCs陽性表達典型的間充質(zhì)標志物如CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90和CD105,ASCs對于造血抗原如CD14、CD31、CD45和CD144表達是陰性的[27]。ASCs在培養(yǎng)的第一代時具有CD34的陽性表達,但在傳代后CD34表達降低[28]。ASCs的表面標志物可以隨著傳代而改變,如造血標志物CD11、CD14、CD34和CD45的表達消失或喪失[29]。另一方面CD29、CD73、CD90和CD166的表達水平從SVF到第2代逐漸增加[27]?，F(xiàn)有存在爭論較多的是CD105、CD146、CD166、CD140b、HLA-DR[30]。

直至目前,沒有明確描述鑒別天然ASCs的標記物。分離培養(yǎng)的ASCs是由幾個亞群的干細胞和前體細胞組成的非均勻細胞群。培養(yǎng)的ASCs的特征在于它們表達一組標志物,但它們的體外表型是動態(tài)的。一些標記物在培養(yǎng)過程中從頭開始表達,隨后部分標記物的表達會喪失。長期以來,CD34表達于表征造血干細胞和造血祖細胞,但現(xiàn)在它是原代培養(yǎng)和短時間內(nèi)鑒定ASCs亞群的潛在標志物。然而,長期培養(yǎng)的ASCs不表達CD34,也可能是人造環(huán)境導致的結(jié)果。此外,ASCs(或其亞群體)的組成可能在不同的實驗室和培養(yǎng)基之間發(fā)生變化。主要原因之一是缺乏ASCs的標準化分離和培養(yǎng)方案[28]。

ASCs從消化脂肪組織的SVF獲得,是一群包含ASCs、血管內(nèi)皮和壁細胞、平滑肌細胞、周細胞、成纖維細胞和循環(huán)細胞的不均勻混合物。本課題組[26]的實驗進行流式細胞術(shù)分析顯示,ASCs的表面標志物與BMSCs相似,這些細胞不表達CD45,但表達CD73,CD105和間充質(zhì)干細胞標志物CD90。盡管已經(jīng)有幾個公布的報告建立了ASCs表型的標志物,但在這個異質(zhì)群體中如何鑒定ASCs仍然缺乏共識。因此,脂肪組織SVF的均質(zhì)亞群分離仍然是一個具有研究價值的課題。

3 ERK與MAPK增殖通路

眾所周知,細胞外信號相關(guān)激酶(extracellular signal-related kinase,ERK)信號通路的激活是調(diào)節(jié)ASCs增殖和分化的機制之一。外部刺激諸如激素、分子因子、物理刺激和環(huán)境變化等作用于ASCs的靶受體激活ERK。激活磷酸化的ERK隨后啟動了ASCs的生物學行為,特別是分化特性相關(guān)下游事件的級聯(lián)反應(yīng)。Liu等[31]報道了由特異性ERK抑制劑PD98059誘導的ERK阻斷磷酸化水平以劑量依賴的方式降低了ASCs的成骨分化,說明ERK信號通路參與ASCs成骨分化。Kim等[32]報道,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路也參與TGF-β1信號通路誘導ASCs的軟骨形成分化。此外,TGF-β1信號激活的SMAD轉(zhuǎn)錄因子與ASCs的軟骨形成活性增加有關(guān)。雖然ERK信號通路可能有利于誘導ASCs的成骨分化,但ERK信號通路在其他細胞系的分化和ASCs的自我更新能力中的作用尚不清楚。另外,據(jù)報道,MAPK信號通路可以控制癌癥的發(fā)展和腫瘤發(fā)生[33]?？傊?在ASCs增殖和分化過程中調(diào)節(jié)的ERK和MAPK信號通路仍存在爭議與不明確性。本課題組[26]在探討體外有效擴增人ASCs的研究顯示低強度脈沖場超聲的物理刺激可促進ASCs增殖,其增殖機制可能與熱傳遞和代謝有關(guān),具體機制仍在探索中。通過物理方法刺激實現(xiàn)干細胞增殖,保持干細胞原有的特性,不受細胞因子等外來因素的影響,對ASCs的研究及臨床應(yīng)用具有重要意義。

4 ASCs再生性能

現(xiàn)有報道,ASCs的再生潛能及調(diào)節(jié)機制可能有如下幾種:第一種機制是ASCs可能通過向特定細胞類型的分化,在體內(nèi)可更換有缺陷的細胞群。然而,隨后有研究者對動物模型進行的研究,在體內(nèi)跟蹤ASCs的作用機制顯示該機制尚未被證實[34]。ASCs除了向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞的分化外,沒有確切的研究證實間充質(zhì)干細胞的分化功能,分化細胞表型僅通過特異性標記的表達驗證[35]。雖然已經(jīng)報道其體外分化為多種表型,但體內(nèi)轉(zhuǎn)化機制仍未明確。有報道,ASCs可在缺血組織中存活,但成熟脂肪細胞在缺血條件下容易死亡,ASCs被注射或移植到缺血組織后細胞存活率差[36],又有報道稱ASCs在缺氧條件下誘導血管生成因子分泌增強[37]。說明了植入后的環(huán)境對于細胞存活非常關(guān)鍵。對于特定的環(huán)境,ASCs移植需要適合的支持細胞附著、增殖和分化的生物材料支架。理想的支架可為細胞提供適合細胞存活的環(huán)境,應(yīng)根據(jù)其多孔特性,如孔隙度、生物活性、機械完整性、生物降解性和低免疫原性等來選擇支架[38]。而ASCs的體內(nèi)分化機制仍需進一步探討。

第二種機制是間充質(zhì)干細胞(MSCs)分化可能出現(xiàn)“多種表型的中間細胞”,這些細胞沒有顯示出特定細胞和基質(zhì)共同表達的標記物,而是ASCs處于一個特定的分化階段只會表達需要分化方向的細胞標記物,沒有展示他們所有的功能。且細胞的轉(zhuǎn)分化是否是融合的結(jié)果,尚未完全明確[16,39]。研究顯示ASCs植入后沒有檢測到細胞融合、分化為肝細胞與宿主肝細胞的證據(jù)[40]。

第三種機制是ASCs的調(diào)節(jié)作用。首先,可能通過刺激內(nèi)源性干細胞,將其招募到受損區(qū)域,然后貢獻于適當?shù)募毎怠Ｆ浯?在組織損傷的部位ASCs可能是一種抗氧化劑,自由基清除劑和伴侶/熱休克蛋白的來源。由于它們的作用,有毒物質(zhì)被分離、去除,使存活的細胞可以恢復(fù)它們的功能。許多研究者認為,ASCs促進組織和器官的細胞再生,主要是通過細胞因子和生長因子的釋放[34]。

近年來,干細胞在治療方面已經(jīng)越來越深入,從遺傳疾病到現(xiàn)代生活方式的疾病,從神經(jīng)到內(nèi)臟再到皮膚,無論男女老少還是輕重緩急,干細胞都發(fā)揮著其重要的再生性能。因此,進一步深入探討ASCs的再生性能將有助于其臨床應(yīng)用。

5 致癌潛能

盡管ASCs對組織工程和再生醫(yī)學發(fā)揮積極作用,但許多研究顯示ASCs具有致癌潛能。體外和動物研究認為,ASCs可與腫瘤細胞相互作用并誘導腫瘤發(fā)生[41]。Chandler等[42]進行了ASCs與腫瘤細胞之間相互作用可能機制的研究,他們發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤分泌的可溶性因子抑制脂肪分化,但增加了ASCs的增殖、促血管生成因子分泌和肌成纖維細胞分化。這種ASCs的行為類似于乳腺腫瘤的特征,通過正交異性小鼠實驗進一步證實了這一結(jié)果。Eterno等[43]研究表明,ASCs可能通過HGF/c-Met/β-catenin軸激活支持乳腺癌細胞的增殖,這對脂肪移植后增加乳腺癌復(fù)發(fā)率非常重要。Schweizer等[44]和Ohuchi等[45]研究卻發(fā)現(xiàn)ASCs誘導乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或通過微環(huán)境誘導乳腺癌惡化。相反,Cousin等[46]報道ASCs可以抑制腫瘤的活力和增殖,具有ASCs條件培養(yǎng)基和胰腺腫瘤細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠在體內(nèi)和體外促進胰腺腫瘤的死亡。在肝、前列腺和結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)由ASCs介導的這種抑制作用。Zhang等[47]發(fā)現(xiàn)ASCs在體內(nèi)體外都可以分化為泌尿系統(tǒng)細胞,揭示ASCs可作為治療泌尿膀胱上皮癌的潛在工具?？傊?ASCs移植的致癌潛力仍不清楚,報道的結(jié)果不一致。

ASCs除了在組織修復(fù)中起作用,還可以影響各種免疫細胞并抑制這些細胞的活化和增殖,這些特征使ASCs對炎癥性疾病的應(yīng)用具有吸引力。ASCs除了同MSCs一樣具有自我更新能力和多能性外,還有免疫抑制特性和低免疫原性等免疫調(diào)節(jié)能力。因此,使用ASCs的臨床試驗應(yīng)結(jié)合患者的病史仔細考慮,特別是對于以前被診斷患有任何癌癥的患者。

6 臨床研究與應(yīng)用

在臨床研究上,ASCs的第一次臨床應(yīng)用是在2004年。近年來,ASCs在組織修復(fù)和再生研究方面,每年顯著增加。研究者們最關(guān)注的是在修復(fù)和再生中使用ASCs的數(shù)量、臨床試驗評價療效和安全性。根據(jù)美國臨床試驗(ClinicalTrials.gov database,2015)報道,有121項研究注冊使用ASCs,這些研究包括治療糖尿病、肝硬化、瘺、心血管疾病、肢體缺血、肌萎縮側(cè)索硬化、脂肪代謝障礙、移植物抗宿主病、克羅恩病、動脈硬化、軟組織填充和骨組織缺損等,其中內(nèi)分泌系統(tǒng)37例,缺血系統(tǒng)17例,軟硬組織34例,其他33例。大多數(shù)涉及胃腸道和泌尿生殖道疾病、軟骨和骨變性和移植物抗宿主病等疾病。基于合法性,ASCs用于韓國和日本的整形美容的臨床治療不受限制。但所有進行的研究大多處于早期階段:0-Ⅰ級43例、Ⅰ/Ⅱ級58例、Ⅲ級5例、Ⅳ級2例、未確定13例,研究數(shù)量不超過100人。所有志愿者中32例為非招募志愿者,60例為招募志愿者,完成25例,中斷5例。大多數(shù)評估干細胞療效的臨床試驗都是在病人招募的早期階段進行,只有20%完成了,5項研究被終止,這些研究被中斷是由于缺乏治療效果[48]。

在臨床應(yīng)用上仍然需要克服較多的困難,如首先是移植的供體與受體的免疫反應(yīng),其次是與植入合成材料之間的相互作用等問題。但是人們試圖通過工程化的ASCs來解決此問題。有研究者通過組織工程在人和裸鼠體內(nèi)將透明質(zhì)酸基支架植入具有ASCs和對照組的臍帶區(qū)域進行研究發(fā)現(xiàn),與裸鼠不同的是人類基于透明質(zhì)酸的支架不支持ASCs存活,無法誘導形成脂肪組織[49,50]。Yoshimura等[51]招募了15例患者,移除人造乳房植入物后,移植含有脂肪抽吸的SVF,并隨訪12個月,其結(jié)論是脂肪組織的體積增加可能不是由于ASCs分化而是通過血管生成和脂肪形成因子的分泌致使組織的旁分泌支持。所以,ASCs的臨床研究與應(yīng)用仍然存在巨大的挑戰(zhàn),需要大量的臨床試驗進一步證實其功能性。

目前正在進行的脂肪干細胞再生潛能評價的臨床試驗大多處于研究的早期階段,主要目標是評估干細胞治療在小范圍內(nèi)患者的安全性及其副作用。大量的研究只包含病例的描述,而不是隨機試驗,對照組結(jié)果不顯著。但是研究者們正在為干細胞的臨床應(yīng)用攻堅克難,在抗抑制宿主病、糖尿病、卵巢早衰、肺病患者、皮膚再造、中風以及創(chuàng)口愈合等取得重大突破。干細胞技術(shù)攻克傳統(tǒng)醫(yī)學不能及的重大疾病的全新醫(yī)療技術(shù),在治療疾病與健康保健方面將有重大的作為。

7 總結(jié)

組織工程、再生醫(yī)學和細胞療法的發(fā)展必將預(yù)防目前許多無法治愈的疾病。ASCs在組織再生中具有突出的貢獻,因為它們在脂肪組織中具有高的細胞產(chǎn)量、分化成多個細胞系的潛能、分泌各種細胞因子的能力和免疫調(diào)節(jié)作用[3,4]。ASCs在塑造和重建手術(shù)中是組織修復(fù)和再生的良好候選者,但脂肪組織工程ASCs離“現(xiàn)成”的產(chǎn)品相差甚遠。雖然生物材料是生物相容性的,在體內(nèi)可以隨著時間而降解,但大多數(shù)是源于動物來源的制劑,具有長期誘導免疫反應(yīng)的可能性,也可能是引起嚴重免疫反應(yīng)的宿主抗體[52]。因此組織工程化的ASCs應(yīng)用需要攻破更大更艱巨的難關(guān),未來研究我們可能需要更加關(guān)注以下內(nèi)容:

第一,進一步優(yōu)化分離培養(yǎng)流程,明確ASCs的作用機制。目前,使用ASCs治療的臨床試驗已經(jīng)有部分正在進行中。然而,很少有Ⅲ期臨床研究被報道。ASCs是再生醫(yī)學有希望的細胞來源,但需要更多的研究來證實ASCs的安全性和使用組織工程ASCs的功效。將ASCs轉(zhuǎn)化為臨床實踐之前,必須解決一些問題。①建立工業(yè)化異種不含動物衍生試劑的培養(yǎng)基,充分認識外來介質(zhì)的安全性和效率,在體內(nèi)進行進一步的研究。②建立長期保持ASCs性質(zhì)的保存方法,以確保ASCs在組織工程和再生醫(yī)學中應(yīng)用的有效性。③明確干細胞向靶細胞的自發(fā)分化,或者細胞遷移和歸巢機制的問題。④進一步深入研究ASCs中生物分子生長因子和生物制造支架之間相互作用的機制。⑤增加組織工程化的ASCs臨床試驗的研究,制定ASCs可作為再生醫(yī)學治療的標準,保證其治療的長期安全性。

第二,進一步深入研究ASCs作為治療工具可能存在的雙面性。未來研究,我們需要考慮更多的問題:是哪些因素給予和支持ASCs最好的治療效果,移植的干細胞在長期治療的基礎(chǔ)上是否能維持其未分化狀態(tài)或是行使其分化功能，其不良分化的可能性和其與腫瘤細胞之間的相互作用;從基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學等多角度對治療效果進行研究與觀察,運用CRISPR Cas9等先進的基因編輯技術(shù)改善組織工程ASCs的功能,不斷探索ASCs不同時期細胞周期的調(diào)節(jié),再通過新一代高通量測序等技術(shù)進行對改造后的細胞或治療后的模型動物的基因進行篩選,不斷優(yōu)化組織工程化ASCs。將其作為一種藥物來研究與開發(fā),而不是一種工具。

總而言之,盡管現(xiàn)有ASCs的研究面臨各種挑戰(zhàn),但由于其豐富的來源,相對簡單的分離獲取過程以及多向分化潛能將會被日益重視,優(yōu)化其治療前分離培養(yǎng)免疫特異性和同質(zhì)性的干細胞群,提高分化為靶細胞的效率,建立最佳的移植階段,提高移植后再生率,不斷克服與完善現(xiàn)有的各種問題。ASCs在再生醫(yī)學中仍然是一個非常有前景的方法。在不久的將來,脂肪組織工程可能會成為各種疾病的制劑產(chǎn)品,使更多的患者受益,不斷為人類帶來更美好的未來。