甘藍(lán)型油菜蕾薹期抗旱相關(guān)性狀的QTL分析

黃 倩，趙永國，黃祥偉，朱宗河，劉云清，馬海清，程 勇，鄒錫玲，徐勁松，張學(xué)昆，陸光遠(yuǎn)

(1.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所， 湖北 武漢 430062；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 安徽 合肥 230036；3.湖北省浠水縣農(nóng)業(yè)局，湖北，浠水，438200)

作物在生長過程中經(jīng)常遭受到各種生物脅迫和非生物脅迫，其中干旱脅迫是非生物脅迫中對作物生長和產(chǎn)量影響最嚴(yán)重的脅迫之一[1]。油菜是重要的油料作物,我國每年油菜種植面積和總產(chǎn)出約占世界的1/3[2]。干旱直接影響油菜的生長，導(dǎo)致油菜總莢數(shù)、每莢粒數(shù)、單株種子數(shù)及單株產(chǎn)量顯著下降[3-4]，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量。長江流域是我國油菜主產(chǎn)區(qū)，雖然降雨充沛，但全年降水分布不均勻，季節(jié)性干旱頻發(fā)[5]，比如2010年發(fā)生的西南五省冬、春季特大干旱，2011年長江中游五省的春、夏季特大干旱。有研究發(fā)現(xiàn)春旱使中國長江中下游地區(qū)的油菜平均減產(chǎn)20%以上[6]。而春旱正值油菜蕾薹期，是生長需水量較大時(shí)期，此時(shí)發(fā)生干旱嚴(yán)重影響油菜的形態(tài)建成，造成地上部營養(yǎng)體偏小，進(jìn)而影響油菜的產(chǎn)量因子的發(fā)育和最后產(chǎn)量的形成[7]。因此，對油菜蕾薹期的抗旱性研究更有意義。

近年來在小麥[8]、大豆[9]、玉米[10]等作物中已經(jīng)開展了較多抗旱相關(guān)性狀的QTL定位研究，但有關(guān)油菜抗旱QTL的研究還鮮見報(bào)道。其中王丹丹[11]以F2∶4群體為材料，采用復(fù)合區(qū)間作圖方法，對苗期葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉片相對含水量、葉片保水力、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)5個(gè)耐旱相關(guān)性狀及其耐旱系數(shù)進(jìn)行了QTL分析，共檢測到8個(gè)QTL。薦紅舉等[12]通過構(gòu)建重組自交系高密度SNP遺傳圖譜，找到8個(gè)與抗旱相關(guān)的QTL位點(diǎn)。前人研究多以葉片脯氨酸含量、萎蔫指數(shù)、植株干重、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、光合速率等作為作物抗旱性狀鑒定指標(biāo)[13-15]。然而，在育種實(shí)踐中往往需要用到更加簡單、直觀的形態(tài)指標(biāo)來判斷植株的抗旱水平，包括產(chǎn)量、株高及葉片萎蔫指數(shù)等。研究這些抗旱相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)是開展抗旱育種的前提。因此，本研究針對長江流域春旱頻發(fā)的特點(diǎn)，利用抗旱能力差異較大的兩個(gè)甘藍(lán)型油菜親本構(gòu)建了一個(gè)F2∶3群體，對甘藍(lán)型油菜蕾薹期抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行了初步的QTL定位，估計(jì)相應(yīng)的QTL效應(yīng)大小，以期為抗旱相關(guān)性狀分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究用到的油菜抗旱親本QY8-1(P1)來源于秦優(yōu)8號(hào)，已經(jīng)過7代自交、選擇，形成純系。干旱敏感親本為滬油16號(hào)(P2)，也已經(jīng)自交多代純合。這兩個(gè)親本的抗旱性經(jīng)過發(fā)芽期、苗期及成株期的綜合鑒定，差異十分明顯[16]。以QY8-1為母本，與滬油16號(hào)雜交得到F1，從中選擇1株套袋自交得到F2，經(jīng)進(jìn)一步培育獲得了F2∶3群體，該群體由183個(gè)家系組成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

抗旱性鑒定試驗(yàn)于2010年10月到2011年5月在干旱棚中進(jìn)行。田間試驗(yàn)采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主區(qū)為水分處理(干旱脅迫和正常供水)，副區(qū)為不同基因型。處理內(nèi)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每小區(qū)種植1行，隨機(jī)區(qū)組排列。整地前按1 500 kg·hm-2均勻施俄羅斯復(fù)合肥(中化化肥有限公司)，N、P、K的比例為16∶16∶16，播種后不再追肥。10月7日播種兩個(gè)親本及 183個(gè)F2∶3家系，每份材料播種一行。播種后立即均勻澆水，保證其正常發(fā)芽和生長。25 d后進(jìn)行間苗和定苗，株、行距分別為0.1 m和0.3 m，行長2.4 m。

水分處理方式：利用噴灌設(shè)施進(jìn)行精量分行供水，土壤含水量利用SM-5M土壤濕度傳感器進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從現(xiàn)蕾期(即小區(qū)75%植株剝開主莖頂端1～2片小葉能見到明顯花蕾的時(shí)期)開始處理，當(dāng)0～40 cm的土壤層平均含水量降低到15%時(shí)認(rèn)為干旱脅迫開始(約需要3 d)，到抽薹期(即小區(qū)75%以上植株主莖伸長且主莖頂端離子葉節(jié)達(dá)10 cm為止)結(jié)束[16]，約持續(xù)30 d，干旱脅迫處理結(jié)束后立即恢復(fù)供水。對照區(qū)則充分供水，使0～40 cm的土壤層平均含水量保持在30%以上。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 性狀考察

葉片萎蔫指數(shù)和植株鮮重的調(diào)查在干旱脅迫后30 d進(jìn)行。首先以小區(qū)為單位，中午時(shí)分連續(xù)觀察并記載萎蔫指數(shù)。油菜萎蔫指數(shù)分為5 級，1級為無萎蔫(賦值為1.00)；2級為輕微萎蔫(<10%植株萎蔫，賦值為0.75)；3級為萎蔫(40%～70%植株萎蔫，賦值為0.50)；4級為明顯萎蔫(>90%植株萎蔫，賦值為0.25)；5級為嚴(yán)重萎蔫(葉片黃化、褐化或大部分葉片死亡或脫落，賦值為0.00)。萎蔫指數(shù)越小，其抗旱性就越差；反之萎蔫指數(shù)越大，則其抗旱性越強(qiáng)。

測完葉片萎蔫指數(shù)后，每行連續(xù)選取5株，連根拔起，立即用清水除凈根部泥土，濾紙吸干，用電子天平測定單株重量，取平均值后即為單株鮮重。抽薹高度在復(fù)水后5 d(即干旱脅迫開始后的35 d)調(diào)查，分別測量正常灌溉和干旱脅迫條件的單株抽薹高度，每家系選5株，最后計(jì)算平均值。各性狀的抗旱系數(shù)計(jì)算方法如下：

抗旱系數(shù)=干旱脅迫下的測定值/正常灌溉條件下的測定值。

1.4 DNA的提取

在親本和F2群體各單株中分別選取2.0 g葉片采用CTAB法[17]提取DNA，用分光光度計(jì)測定DNA濃度，調(diào)整到50 ng·μL-1后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SRAP標(biāo)記分析

SRAP引物由上海生工合成提供[18]。其中上游引物8條(Me01-Me08)，下游引物20條(Em01-Em20)(表1)，一共組成160對引物。PCR反應(yīng)體系為：10×Taq Buffer(含Mg2+)1 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL、50 ng·μL-1引物0.9 μL、5 U·μL-1Taq DNA多聚酶0.25 μL、50 ng·μL-1DNA模版0.5 μL，加ddH2O至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性3 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性PAGE凝膠上分進(jìn)行電泳檢測，銀染法顯色。

1.6 遺傳作圖和QTL分析

將LOD最小值設(shè)為2.0，應(yīng)用軟件MapMaker3.0[19]構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜。用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距，并進(jìn)一步用MapDraw軟件畫出連鎖圖譜[20]。應(yīng)用軟件WinQTLCart 2.5[21]的復(fù)合區(qū)間作圖法對抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位分析。重復(fù)抽樣1 000次，取LOD值2.0為QTL存在的閾值，QTL的命名按“性狀+處理?xiàng)l件+序號(hào)”進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及群體的抗旱性表現(xiàn)

在干旱脅迫和正常灌溉條件下，比較了兩個(gè)親本P1(QY8-1)、P2(滬油16)及F2∶3群體的抗旱性。由表2所示，甘藍(lán)型油菜三個(gè)性狀在兩親本之間存在明顯差異。與正常灌溉相比，干旱脅迫下P1的抽薹高度下降了21.2%，而P2下降幅度高達(dá)59%，是P1的2.8倍。葉片萎蔫指數(shù)的對比更明顯，在正常條件下P1和P2都在0.98以上，但在干旱條件下P1略有下降(0.80)，而P2則大幅度下降到0.36，僅有前者的45%(0.36/0.80)。同樣，在干旱條件下單株鮮重也受到嚴(yán)重影響，P1、P2分別下降了52.5%和64.2%。以上結(jié)果表明，干旱對抽薹高度、單株鮮重以及葉片萎蔫指數(shù)等性狀的影響較大，而且存在基因型差異，其中親本P1的抗旱性較好，P2的抗旱性較差。

表1 本研究利用的SRAP引物序列

經(jīng)干旱處理后，由親本P1和P2構(gòu)建的F2∶3家系各性狀也明顯變化(表2)。其中，抽薹高度平均下降了53.6%，單株鮮重平均下降了55.3%，葉片萎蔫指數(shù)平均下降了52.6%。在干旱脅迫和正常供水兩種環(huán)境下，F(xiàn)2∶3家系的各性狀值為連續(xù)分布表明為多基因控制的數(shù)量性狀。正態(tài)分布檢測表明，這些性狀分布基本符合正態(tài)分布，適合于QTL分析。

表2甘藍(lán)型油菜親本及群體抗旱相關(guān)性狀的表現(xiàn)

Table 2 Evaluation of drought related traits in rapeseed parents and population

性狀Trait處理Treatment親本ParentQY8-1滬油16Huyou16F2∶3Family均值Mean最小值Min最大值Max方差Variance偏度Skewness峰度Kurtosis抽薹高度/cmShootheight單株鮮重/(Plant·g-1)Freshweight葉片萎蔫指數(shù)Leafwiltingindex灌溉Watered60.4020.0047.1015.4081.60182.400.23-0.41干旱Drought47.608.2021.801.6058.20160.800.73-0.08灌溉Watered275.40244.20270.80240.00299.80155.20-0.18-2.46干旱Drought130.8087.40120.9097.80148.2066.400.10-1.51灌溉Watered0.990.980.970.951.000.00.09-0.97干旱Drought0.800.360.460.100.890.10.18-1.30

葉片萎蔫指數(shù)是反映植物抗旱性最直觀的指標(biāo)[22]。相關(guān)性分析表明，在干旱脅迫下F2∶3群體的葉片萎蔫指數(shù)與抽薹高度及單株鮮重均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.829**和0.734**；單株鮮重也與抽薹高度呈極顯著正相關(guān)(r=0.734**)(表3)，由此可見，抽薹高度與單株鮮重也是衡量抗旱性的重要指標(biāo)，而且這些性狀可能受到某些共同的遺傳控制。另外，上述性狀抗旱系數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)更高，均在0.996以上(表3)，進(jìn)一步說明了這三個(gè)性狀之間具有密切的關(guān)系。

表3 F2∶3群體在干旱脅迫下性狀(上三角)及其抗旱系數(shù)(下三角)間相關(guān)性分析

注：**表示在0.01水平上顯著。

Note：** represent statistically significant atP<0.01.

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

在油菜親本P1和P2中共篩選了160對SRAP引物，擴(kuò)增條帶數(shù)在5～46之間，多態(tài)性片段數(shù)量在1～13之間，平均為4.2條。按照多態(tài)性標(biāo)記、多條帶清晰的原則，最終選擇了75對引物進(jìn)行群體分析，共得到了388個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，平均每對引物組合產(chǎn)生5.2個(gè)標(biāo)記。

對群體中檢測到的388個(gè)標(biāo)記進(jìn)行遺傳作圖，發(fā)現(xiàn)共有335個(gè)標(biāo)記可以進(jìn)入連鎖群，剩余的53個(gè)標(biāo)記無法進(jìn)入連鎖群。該遺傳圖譜包含了21個(gè)連鎖群，其中LG1包含的標(biāo)記數(shù)目最多，達(dá)53個(gè)；LG21的標(biāo)記數(shù)目最少，僅有4個(gè)。單個(gè)連鎖群的遺傳圖距在32.4～238.3 cM之間，整個(gè)連鎖遺傳圖譜長度為1661.9 cM，標(biāo)記間的平均距離為4.96 cM，滿足QTL定位標(biāo)記間距離小于15 cM的要求[23]。

2.3 抗旱相關(guān)性狀的QTL分析

利用復(fù)合區(qū)間作圖法，在正常灌溉和干旱脅迫下分別對抽薹高度、單株鮮重、葉片萎蔫指數(shù)及這些性狀的抗旱系數(shù)進(jìn)行QTL分析，一共找到了28個(gè)QTL，分布在21個(gè)連鎖群中的14個(gè)連鎖群上(圖1)，可解釋的表現(xiàn)變異在1.1%～36.6%之間不等(表4)。

2.3.1 抽薹高度 共檢測到10個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于第1、5、9、10、12、15和19連鎖群上(圖1)。單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率在4.3%至36.6%之間，其中在干旱脅迫下6個(gè)，正常灌溉條件下2個(gè)，抗旱系數(shù)2個(gè)(表4)。qSH-W-1、qSH-W-2、qSH-D-1、qSH-D-3、qSH-DRI-2的加性效應(yīng)均來自滬油16的增效作用，其它5個(gè)QTL的加性效應(yīng)均來自QY8-1的增效作用。其中，在干旱脅迫下定位到的qSH-D-5位于第15連鎖群標(biāo)，能解釋36.6%的表型變異，屬于主效QTL。利用抗旱系數(shù)檢測到的qSH-DRI-1與主效QTLqSH-D-5位于同一連鎖群，都位于Em07/Me04-6—Em02/Me20-3區(qū)間，但貢獻(xiàn)率僅有6.5%。

2.3.2 單株鮮重 共檢測到12個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于第2、8、11、12、13、16、19連鎖群上(圖1)。單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率在1.6%到11.2%之間。其中干旱脅迫下2個(gè)，正常灌溉條件下6個(gè)，抗旱系數(shù)4個(gè)(表4)。qFW-DRI-3、qFW-DRI-2、qFW-D-2、qFW-DRI-4的加性效應(yīng)均來自QY8-1的增效作用，qFW-W-2的加性效應(yīng)為0，其余的QTL的加性效應(yīng)為負(fù)值。其中qFW-D-2的遺傳貢獻(xiàn)率最大(R2=8.7%)。正常灌溉下檢測到的qFW-W-3與利用抗旱系數(shù)檢測到的qFW-DRI-2都位于第11連鎖群的同一位置，貢獻(xiàn)率分別為4.9%和4.0%。

注：白色、紅色和藍(lán)色圖案分別代表正常供水、干旱處理和抗旱系數(shù)Note: White, red, and blue color indicate the watered condition, drought stress, and drought resistant index, respectively

注：q, QTL; SH, 抽薹高度; FW, 單株鮮重; LWI, 葉片萎蔫指數(shù); W, 正常供水; D, 干旱處理; DRI, 抗旱系數(shù)。

Note: SH, shoot height; FW, plant fresh weight; LWI, leaf wilting index; W, water supply; D, drought stress; DRI, drought resistant index.

2.3.3 葉片萎蔫指數(shù) 共檢測到6個(gè)QTL位點(diǎn)，分別位于第4、8、15、16連鎖群上。單個(gè)QTL的遺傳貢獻(xiàn)率在1.1%到13.5%之間。其中干旱脅迫下檢測到2個(gè)，正常灌溉條件下3個(gè)，抗旱系數(shù)1個(gè)(表4)。除了qLWI-W-2和qLWI-D-2的加性效應(yīng)是負(fù)值，其它QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)都是正值，增效位點(diǎn)來源于親本QY8-1。在干旱脅迫下檢測到的qLWI-D-1能解釋5.2%的表型變異，位于第15連鎖群，相同位置還檢測到抗旱系數(shù)的QTLqLWI-DRI-1，其貢獻(xiàn)率為3.1%。同樣，在第16連鎖群的標(biāo)記區(qū)間Em01/Me12-1—Em01/Me09-1也檢測到兩個(gè)重疊的QTL(qLWI-W-3和qLWI-D-2)，但貢獻(xiàn)率僅有1.1%～4.5%，屬于微效QTL。

3 討 論

在干旱脅迫下，兩個(gè)親本的性狀差異較明顯，例如QY8-1的抽薹高度為47.6 cm，而滬油16的抽薹高度僅有8.2 cm，明顯低于前者。另外兩個(gè)指標(biāo)(單株鮮重和葉片萎蔫指數(shù))也是如此，說明現(xiàn)蕾至抽薹時(shí)期的干旱對油菜的生長和發(fā)育產(chǎn)生重要影響，而且不同基因型對干旱脅迫的反應(yīng)存在差異，其中QY8-1的抗旱性較好，滬油16的抗旱性較差。F2∶3群體中除了在干旱脅迫條件下的單株鮮重以外，其它各性狀在不同環(huán)境處理下均為超雙親表現(xiàn)，說明兩個(gè)親本間既存在增效基因又存在減效基因，通過基因的重新組合有望在群體后代中篩選到抗旱性顯著增強(qiáng)的新材料。

國內(nèi)外有關(guān)甘藍(lán)型油菜抗旱相關(guān)性狀QTL研究報(bào)道較少。Li等[24]利用性狀差異大的甘藍(lán)型油菜親本構(gòu)建了一個(gè)DH群體,利用該群體在苗期對株高、根長、地上部干重、根干重及總干重等性狀進(jìn)行了QTL分析，在不同水分脅迫下共定位到51個(gè)QTL，其中利用抗旱系數(shù)為性狀共掃描到19個(gè)QTL。本研究利用F2∶3群體在抽薹期共定位到28個(gè)抗旱相關(guān)QTL，明顯少于上述報(bào)道?？赡茉蚴莾烧呤褂玫娜后w類型不同，檢測時(shí)期不同，以及測定指標(biāo)也不盡相同。另外，油菜在不同發(fā)育時(shí)期的抗旱性及其采用的應(yīng)對策略也是變化的(陸光遠(yuǎn)等，未發(fā)表)。本研究還發(fā)現(xiàn)了許多重疊的QTL(比如LG8、LG11、LG13、LG14、LG15、LG16和LG19上分別可測到2～4個(gè)重疊的QTL，見圖1)，一方面說明QTL檢測結(jié)果的可靠性，另一方面也說明部分QTL位點(diǎn)具有一因多效作用，即一個(gè)QTL可以同時(shí)控制多個(gè)性狀，這也部分解釋了抽薹高度、單株鮮重以及葉片萎蔫指數(shù)之間存在的高度相關(guān)性(表3)。Li等[24]也觀察到類似現(xiàn)象，他們發(fā)現(xiàn)株高抗旱系數(shù)、根干重抗旱系數(shù)以及總干重抗旱系數(shù)的QTL都定位在第1連鎖群的相同區(qū)域，而且這三個(gè)性狀之間也顯著相關(guān)。

4 結(jié) 論

利用一個(gè)甘藍(lán)型油菜F2∶3群體在抽薹期進(jìn)行抗旱性鑒定和QTL分析，共檢測到28個(gè)QTL，其貢獻(xiàn)率在1.1%～36.6%之間。其中在LG15連鎖群上檢測到4個(gè)重疊的QTL，貢獻(xiàn)率最大為36.6%，在抗旱育種中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。在LG16連鎖群上也檢測到4個(gè)重疊的QTL，但貢獻(xiàn)率在8.1%以下，屬于微效QTL，但在育種選擇中也應(yīng)予以考慮。

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