食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展

劉生峰， 楊 俊， 陸麗華

(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶 400020)

食品微生物檢驗(yàn)是食品衛(wèi)生安全評(píng)價(jià)的重要技術(shù)手段之一。近年來(lái)，隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展以及社會(huì)主義精神文明建設(shè)的不斷提高，食品安全愈來(lái)愈受到社會(huì)的廣泛關(guān)注，食品微生物檢驗(yàn)在服務(wù)社會(huì)公眾及政府職能部門對(duì)食品安全進(jìn)行評(píng)價(jià)及質(zhì)量監(jiān)管方面發(fā)揮著重要作用。然而，食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的現(xiàn)狀并不令人滿意，檢驗(yàn)操作繁瑣、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、檢驗(yàn)工作效率低等問(wèn)題一直是困擾食品微生物檢驗(yàn)工作的技術(shù)瓶頸,與當(dāng)前社會(huì)的發(fā)展需求有著較大的差距。因此，如何發(fā)展快速、高效、準(zhǔn)確的微生物檢驗(yàn)新技術(shù)和方法，滿足社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求，是食品微生物檢驗(yàn)工作的當(dāng)務(wù)之急[1-2]。

1 食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)狀

長(zhǎng)期以來(lái)，食品微生物檢驗(yàn)一直遵循增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學(xué)及生化、血清學(xué)鑒定這樣的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)方法具有準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，但卻存在檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、檢驗(yàn)操作繁瑣、效率不高的問(wèn)題。如增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定等步驟通常都分別需要1 d以上的培養(yǎng)時(shí)間；平板分離的挑菌落步驟，需要有一定工作經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員才能勝任；鑒定一個(gè)對(duì)象菌需要做多個(gè)生化試驗(yàn)才能完成等[3]。2003年以前我國(guó)發(fā)布的食品微生物檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789標(biāo)準(zhǔn)系列)幾乎都是采用上述傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法。直到2008年以后發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中才開始逐漸引入了一些新的檢測(cè)技術(shù)和方法。如：GB4789.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)；GB/T 4789.36-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗(yàn)等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中就引入儀器自動(dòng)化生化鑒定方法、免疫磁珠捕獲法、全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法、全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法等新技術(shù)方法。國(guó)家質(zhì)檢總局近年來(lái)發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，也有引入PCR檢測(cè)方法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法、基因芯片法等一些新的檢驗(yàn)技術(shù)方法。如SN/T2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR檢測(cè)方法；SN/T2754-2011出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法系列標(biāo)準(zhǔn)；SN/T2651-2010肉及肉制品中常見(jiàn)致病菌檢測(cè)方法 基因芯片法等。

2 微生物檢驗(yàn)技術(shù)的新進(jìn)展

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、儀器自動(dòng)化分析技術(shù)等各種生物分析技術(shù)的快速發(fā)展，食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)也有了新突破，出現(xiàn)了許多新的檢測(cè)技術(shù)和方法。

2.1 基于傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)上的改進(jìn)

對(duì)一些培養(yǎng)基成分進(jìn)行改良，提高培養(yǎng)基的特異性增菌或分離效果，如：沙門氏菌、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基；對(duì)培養(yǎng)基的使用便利性進(jìn)行改進(jìn)，如快速檢測(cè)紙片、集成化的生化鑒定試劑條及儀器自動(dòng)化技術(shù)。將傳統(tǒng)檢驗(yàn)中比較繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)儀器自動(dòng)化完成，如：生物梅里埃的VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)[4-5]，即是通過(guò)儀器自動(dòng)化完成微生物的生化鑒定及結(jié)果分析工作。

2.2 免疫學(xué)快速篩選方法

由于免疫學(xué)反應(yīng)的快速、靈敏、特異性等特點(diǎn)，可以將其用于目標(biāo)微生物的快速篩選[6]。如：大腸埃希菌O157∶H7的乳膠凝集試驗(yàn)、沙門氏菌的膠體金快速檢測(cè)試劑條等。這類方法可以對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行簡(jiǎn)單的快速篩選。免疫磁珠捕獲法則是通過(guò)免疫磁珠對(duì)目標(biāo)微生物的富集，提高傳統(tǒng)方法的敏感性[7]。全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法則是將微生物的免疫學(xué)篩選由儀器自動(dòng)化完成。

2.3 基于核酸擴(kuò)增的分子診測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于核酸擴(kuò)增的各種微生物檢測(cè)新技術(shù)和新方法不斷涌現(xiàn)。出現(xiàn)最多的是PCR方法和熒光定量PCR方法[8-9]。此外還有基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法[10]、NASBA方法[11]等。這類方法首先都需要對(duì)目標(biāo)微生物的核酸保守序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異性引物，建立核酸擴(kuò)增體系。通過(guò)擴(kuò)增體系中引物對(duì)目標(biāo)微生物特征核酸片段的快速擴(kuò)增，使目標(biāo)微生物的特征核酸片段數(shù)量迅速放大，進(jìn)而能夠檢測(cè)到擴(kuò)增的目標(biāo)核酸片段。其優(yōu)點(diǎn)是能在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)微生物的特征核酸片段數(shù)量擴(kuò)增放大，從而達(dá)到快速篩選目標(biāo)微生物的目的。

此后，在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上又發(fā)展了多重PCR技術(shù)。即：針對(duì)多個(gè)目標(biāo)微生物的核酸序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，對(duì)多個(gè)目標(biāo)微生物的核酸片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、基因芯片雜交等技術(shù)進(jìn)行結(jié)果分析，進(jìn)而發(fā)展出一些多項(xiàng)目并行檢測(cè)的高通量檢測(cè)方法。如Shin等[12]基于細(xì)菌的16S rRNA設(shè)計(jì)寡核苷酸探針建立了可同步建成食品中16種致病菌的基因芯片檢測(cè)方法；肖進(jìn)文等[13]針對(duì)肉及肉制品中沙門氏菌等5種致病菌建立的基因芯片方法等。多重PCR技術(shù)具有節(jié)約成本、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，一次能擴(kuò)增多個(gè)目的基因片段。但該技術(shù)隨著引物對(duì)數(shù)的增多，擴(kuò)增體系的條件摸索較復(fù)雜，容易出現(xiàn)多重PCR擴(kuò)增過(guò)程中各對(duì)引物擴(kuò)增效率不均以及非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題。于是有人開始研究對(duì)多重PCR技術(shù)的改進(jìn)方法,Zhou等[14]針對(duì)食品中6種致病菌建立的GeXP(GenomeLab Gene Expression Profiler)多重基因分析方法(圖1)是一種新型的多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳分析的高通量分析方法。該法在設(shè)計(jì)引物時(shí)，設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，并在特異性引物一端加上一段能被通用引物識(shí)別的標(biāo)簽序列。多重PCR過(guò)程分兩個(gè)階段完成：初始階段由特異性引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，第二階段則是由通用引物對(duì)初始擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增。初期擴(kuò)增是在低濃度下的特異性擴(kuò)增，各引物間的擴(kuò)增效率不易受到影響。第二階段擴(kuò)增由一對(duì)通用引物引導(dǎo)，與一對(duì)引物的PCR擴(kuò)增體類似。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分析。該法較好地解決了多重PCR擴(kuò)增過(guò)程中各對(duì)引物擴(kuò)增效率不均的難題。對(duì)6種目標(biāo)菌的靶序列同時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，能達(dá)到滿意的擴(kuò)增結(jié)果。Villamizar-RG等[15]則是把多重PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合，建立一種經(jīng)過(guò)通用方法前增菌富集后可同步檢測(cè)9種致病菌的高效靈敏檢測(cè)方法。

此外，錢雪峰等[16]利用Tem-PCR結(jié)合Luminex技術(shù)建立了對(duì)葡萄球菌及其耐藥基因進(jìn)行快速檢測(cè)的高通量檢測(cè)方法。Tem-PCR技術(shù)跟GeXP技術(shù)類似，設(shè)計(jì)待擴(kuò)增的每一種靶序列的特異性引物，增加一對(duì)超級(jí)引物，特異性引物中帶有能被超級(jí)引物識(shí)別的標(biāo)簽序列。擴(kuò)增過(guò)程分三個(gè)階段：富集階段、加標(biāo)階段和擴(kuò)增階段。富集和加標(biāo)階段是低濃度下，特異性異物對(duì)靶標(biāo)序列的特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增階段是高濃度的超級(jí)引物對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的大批量擴(kuò)增。該法能同時(shí)對(duì)葡萄球菌的18種分子標(biāo)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。Tem-PCR擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)Luminex液相芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 其他新興的微生物檢測(cè)技術(shù)和方法

脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)鑒定微生物，則是另一種基于核酸分子的微生物分型鑒定技術(shù)。如：范放等[17]利用脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)對(duì)進(jìn)出口食品中的腸炎沙門氏菌進(jìn)行分子分型分析，建立了腸炎沙門氏菌的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。該法通過(guò)限制性內(nèi)切酶對(duì)核酸分子進(jìn)行切割，用脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)對(duì)酶切后的核酸片段進(jìn)行分離，得到不同大小核酸片段的脈沖場(chǎng)電泳條帶。在相同條件下，同種微生物核酸分子形成的脈沖場(chǎng)電泳條帶是相同的，不同微生物核酸分子形成的脈沖場(chǎng)電泳條帶不同。據(jù)此，可用已知微生物建立DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，將待檢菌核酸分子的脈沖場(chǎng)電泳條帶與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌的脈沖場(chǎng)電泳條帶比對(duì)，從而達(dá)到鑒定微生物的目的。

圖2 MALDI-TOF MS技術(shù)原理Fig.2 Principle of MALDI-TOF MS

此外，由生物梅里埃公司等推出的MALDI-TOF MS(圖2)微生物基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)，是微生物分析的又一種全新技術(shù)。該法以飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)為核心，微生物細(xì)胞在特定條件下裂解、離子化，形成若干分子量大小不同的離子碎片，離子碎片在真空飛行管中自由飛行，分子量越小，飛行速度越快，越先到達(dá)飛行管末端，而位于飛行管末端的檢測(cè)器就能依次檢測(cè)到不同質(zhì)量碎片到達(dá)的信號(hào)，從而得到細(xì)胞裂解碎片的質(zhì)譜圖。同一種微生物細(xì)胞在相同裂解條件下，得到的飛行質(zhì)譜圖是相同的；不同微生物細(xì)胞裂解所得到的飛行質(zhì)譜圖不相同。據(jù)此，可以首先用已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株細(xì)胞經(jīng)時(shí)間飛行質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到該菌株的特征質(zhì)譜圖，建立標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。將待檢菌株通過(guò)飛行質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，得到待檢菌株的質(zhì)譜圖，待檢菌株的質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，得出鑒定結(jié)果[18]。該法能夠在數(shù)十分鐘內(nèi)對(duì)細(xì)菌、真菌等進(jìn)行快速鑒定，是目前最高效的微生物儀器鑒定方法之一。

微生物學(xué)與其他學(xué)科相結(jié)合，如生物傳感器技術(shù)[19]、電化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光技術(shù)等的結(jié)合也誕生出一些新型的檢測(cè)方法。如Sharp等[20]報(bào)道了利用噬菌體介導(dǎo)生物發(fā)光技術(shù)檢測(cè)食品中炭疽桿菌的快速檢測(cè)方法。

圖3 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)原理Fig.3 Principle of Flow Cytometry

在微生物的計(jì)數(shù)檢測(cè)方面也有一些新技術(shù)出現(xiàn)。如碧迪公司的BD FACS MicroCount全自動(dòng)微生物計(jì)數(shù)分析儀直接計(jì)數(shù)法(圖3)。該法將流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)和熒光染色技術(shù)結(jié)合，對(duì)樣本中的活菌、死菌直接進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)分鐘內(nèi)就能得到直接計(jì)數(shù)結(jié)果。與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法至少需要1 d以上培養(yǎng)時(shí)間相比，其效率有了質(zhì)的飛躍。

3 展 望

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)和儀器分析技術(shù)的飛速發(fā)展，為食品微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了新的契機(jī)。以傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的儀器自動(dòng)化技術(shù)日趨成熟，將愈來(lái)愈多地應(yīng)用到日常檢驗(yàn)工作中。基于核酸擴(kuò)增的PCR方法、熒光定量PCR方法以及環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法等技術(shù)，因其快速、靈敏的特點(diǎn)，將會(huì)在食品微生物檢驗(yàn)工作中得到進(jìn)一步的發(fā)展?；蛐酒夹g(shù)、GeXP技術(shù)、Tem-PCR技術(shù)、Luminex液相芯片技術(shù)等多項(xiàng)目并行檢測(cè)技術(shù)，是大批量樣本檢測(cè)工作中更加快速、高效的高通量檢測(cè)方法，值得進(jìn)一步探索和發(fā)展。DNA指紋分析技術(shù)是在分子水平上對(duì)微生物進(jìn)行分型鑒定的一種新嘗試。MALDI-TOF MS飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)，能夠大幅度提升微生物鑒定的工作效率，是一種全新高效的微生物快速鑒定技術(shù)?；诹魇郊?xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)和熒光染色技術(shù)結(jié)合的微生物直接計(jì)數(shù)技術(shù)，是真正意義上的微生物直接計(jì)數(shù)，能夠?qū)鹘y(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)檢測(cè)時(shí)間由數(shù)天縮短到數(shù)十分鐘，是微生物計(jì)數(shù)檢測(cè)技術(shù)的革命性發(fā)展。

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