疏花水柏枝內(nèi)生真菌QY-1的抗氧化活性分析

蔣 維， 秦王閣閣， 孔玉珊， 李 輝， 薛艷紅， 劉士平

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

植物內(nèi)生菌(endophyte)是一類生活于健康植物組織或器官內(nèi)部的微生物[1]，近年來研究表明，內(nèi)生菌不僅分布廣泛，有極高的多樣性[2]，而且經(jīng)過漫長的“協(xié)同進化”后，其發(fā)酵產(chǎn)物種類豐富，生物活性廣泛，是開發(fā)新型天然產(chǎn)物的重要來源[2]，成為微生物學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)一個備受關(guān)注的交叉熱點[1-2]。疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)是一種特異分布在三峽消落帶地區(qū)的瀕危植物[3]，每年要承受4～6個月的淹水脅迫[3]。淹水會導(dǎo)致供氧量減少，隨后發(fā)生的不完全氧化將影響植物體正常的生長發(fā)育[4]。在這特殊生境的脅迫下，疏花水柏枝經(jīng)過常年的進化，形成了一套抗氧化脅迫機制來應(yīng)對。如：從疏花水柏枝中分離出一種叫3,4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的物質(zhì)，具有極強的抗氧化能力[5]。其內(nèi)生真菌資源豐富[6]，且具備極強的抗氧化能力[6]。在前期研究中，本實驗室在疏花水柏枝的根部分離到1株內(nèi)生煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，其發(fā)酵液粗提物的抗氧化活性達到同濃度維生素C的30%[7]，暗示內(nèi)生菌通過強抗氧化能力在疏花水柏枝長期對抗水淹脅迫的生態(tài)適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。針對在寄主經(jīng)受氧化脅迫分離的內(nèi)生菌是否具有高抗氧化活性這一化學(xué)生態(tài)學(xué)的問題，本研究從疏花水柏枝分離的一株經(jīng)初篩具高抗氧化活性內(nèi)生真菌出發(fā)，對其進行了分子鑒定，結(jié)合體外和體內(nèi)的方法，對發(fā)酵液提取物及其主成分的抗氧化能力進行了綜合評價，并提出了可能的作用機理，這些研究將為該菌株的進一步應(yīng)用和天然抗氧化劑的篩選與研發(fā)提供了參考，同時對明確特殊生境下內(nèi)生真菌與宿主的化學(xué)生態(tài)學(xué)關(guān)系有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株QY-1分離自淹水前疏花水柏枝的葉片中，適度厭氧條件下獲得[6]，4 ℃石蠟保藏。后期的研究發(fā)現(xiàn)QY-1在正常有氧狀態(tài)下也可生長，故在實驗中采用正常的有氧培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、LB、DMEM/F-12 完全培養(yǎng)基等[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分子鑒定 將4 ℃保藏的QY-1接種于PDA固體培養(yǎng)基中，具體鑒定辦法參照高媛等[7]的辦法進行。將獲得的序列采用Mega5.0軟件進行多重對比，用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 分離提取及胞外抗氧化能力測定 菌株的PDA發(fā)酵液直接用總抗氧化試劑盒(T-AOC，南京建成生物工程研究所)進行測定[6]。其粗提物分別采用DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法[9-10]和鐵氰化鉀(Potassium Ferricyanide，PF)還原力測定法[9-10]測定其抗氧化能力，各重復(fù)3次，以相同濃度的維生素C作為正對照。粗提方法：將QY-1于200 mL (500 mL錐形瓶) PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，然后將菌懸液通過真空抽濾裝置過濾，得菌體與發(fā)酵液。菌體用70%丙酮常溫浸提24 h，浸提3次，超聲1.5 h，過濾菌絲，55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得菌體相粗提物。發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次得酯相和水相，分別在45 ℃和40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥合并得到發(fā)酵液粗提物。將QY-1 粗提物用甲醇溶解后，選用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=7∶3∶0.1進行薄層色譜，獲得一主物質(zhì)SF2，抗氧化能力分析同前。

1.2.3 胞內(nèi)抗氧化作用分析 為進一步確定QY-1代謝物質(zhì)在細胞內(nèi)的活性，分別以原核生物代表(大腸埃希菌DH5α)、真核生物人神經(jīng)母瘤細胞SH-SY5Y為測試對象，分別建立了200 μmol/L 和800 μmol/L的H2O2氧化損傷模型，測定其粗提物對過氧化氫的損傷保護作用。先將大腸埃希菌在LB培養(yǎng)基中37 ℃、100 r/min培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的發(fā)酵液粗提物，培養(yǎng)12 h后，加入濃度為200 μmol/L 的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用分光光度計測定其在600 nm的吸光值，計算大腸埃希菌細胞的存活率，以1 mg/mL的維生素C做正對照。抑制率(%)=((正常生長下的吸光值-處理下的吸光值)/正常生長下的吸光值)×100%。神經(jīng)細胞的氧化損傷保護作用參照Huang等[8]的方法進行，用MTT法測細胞存活率。乳酸脫氫酶(LDH)滲漏率檢測時將QY-1粗提物的濃度控制在1 000 μg/mL，具體按照試劑盒(Biovision，美國)提供的方法進行；凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9及SOD(超氧化物歧化酶)的活性檢測使用碧云天生物技術(shù)公司試劑盒，具體方法見產(chǎn)品使用說明。所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次，通過spss19.0統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌菌株QY-1的鑒定

內(nèi)生真菌QY-1分離自疏花水柏枝淹水前厭氧條件下的葉片中，菌落在PDA上生長緩慢，初期菌落為白色絨毛狀，漸變成暗青色，里層顏色較深，呈黃褐色，菌絲呈放射狀(圖1A)，背面為米黃色，菌落難以挑起，液體發(fā)酵溶液較深，呈黃褐色，菌絲無色透明，有分支和隔膜(圖1B)，近球形的子囊殼散生或群生(圖1C)。

圖1 QY-1的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及分子鑒定Fig.1 Morphology of colony, hyphae & conidia and molecular characterization of QY-1A：菌落形態(tài)；B：顯微形態(tài)；C：子囊殼；D：基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹A: Morphology of colony; B: Back of the dish; C: Micromorphology；D：Phylogenetic tree

將QY-1的總DNA提取后，以其為模板，使用通用上游引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，得到約600 bp的片段，回收后在上海瑞迪生物科技有限公司測序，其18S rDNA的ITS序列通過EditSeq軟件拼接，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號為KU954091)中進行BLAST比對和同源性分析，并采用Mega 5.0軟件，用N-J法建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1D)。結(jié)果表明，菌株QY-1 18S rDNA的ITS序列與球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)的序列相似性為100%，對照《真菌鑒定手冊》[11]，比較分析QY-1和球毛殼菌的形態(tài)特征，判斷QY-1是1株球毛殼菌。

2.2 QY-1在細胞外的抗氧化能力

在初篩時菌株QY-1就顯示出極強的胞外抗氧化能力，其發(fā)酵液的總抗氧化活力(T-AOC) 達到55.90 U/mL, 遠高于分離自山東泰安的青檀葉片中球毛殼菌No.81(其總抗氧化能力為16.12 U/mL[12],表1)，而且在本實驗室從疏花水柏枝分離的163株內(nèi)生真菌中(平均總抗氧化活力6.22 U/mL)，QY-1的抗氧化能力是最高的(表1)。將QY-1的發(fā)酵產(chǎn)物抽提后，將菌體相和發(fā)酵液相的物質(zhì)分別配成1 mg/mL溶液，利用T-AOC試劑盒測定其總抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是菌體還是發(fā)酵液都含有大量的抗氧化物質(zhì)(表1)，雖然QY-1在菌體相的抗氧化活性要高一些，但是由于菌體干物質(zhì)量少(0.1～0.2 mg/100 mL)，所以后期實驗采用發(fā)酵液來評價QY-1的抗氧化活性。用三種方法分析比較了QY-1發(fā)酵液提取物的抗氧化能力，結(jié)果表明不論是自由基清除率、總抗氧化活力，還是鐵氰化鉀還原力，QY-1都表現(xiàn)得非常出色，說明QY-1的提取物有著比較全面的抗氧化能力，達到同等濃度維生素C的50%水平。

表1 QY-1在細胞外的抗氧化能力

注：a：從疏花水柏枝中分離的163個內(nèi)生真菌高抗氧化活性的平均值；b：粗提物和Vc的濃度均為1 mg/mL；“-”表示未測定

2.3 QY-1在細胞內(nèi)的抗氧化能力

為進一步評價QY-1粗提物的抗氧化活性，利用本實驗室建立的大腸埃希菌和人神經(jīng)母瘤細胞的過氧化氫損傷模型，檢測其是否對原核細胞和真核細胞具有氧化損傷保護作用。表2分析了QY-1的發(fā)酵液粗提物對大腸埃希菌的氧化損傷保護作用。質(zhì)量濃度為10 mg/mL的提取物可以促進大腸埃希菌的生長，說明QY-1的粗提物對細胞生長沒有毒害，反而有促進增殖作用。在200 μmol/L 的H2O2存在下，大腸埃希菌的生長明顯受到抑制，抑制率達到55.39%，但是這種抑制效應(yīng)在加有QY-1提取物時能夠完全避免(表2)，2 mg/mL的QY-1提取物的保護效果達到1 mg/mL維生素C的50%。在2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著提取物濃度增高大腸埃希菌細胞的存活率不斷提高，將H2O2的抑制效應(yīng)逐漸縮小。

表2 QY-1粗提物對大腸埃希菌細胞氧化損傷的保護作用

需要指出的是，這種保護作用不能排除是由于QY-1粗提物促進原核細胞增殖所致(表2)，因為在不加H2O2時，效果也很明顯。為了進一步明確QY-1粗提物對真核細胞是否具有氧化損傷保護作用，選用人神經(jīng)母瘤細胞SH-SY5Y，測定了在800 μmol/L的H2O2存在下細胞的存活率(圖2)。結(jié)果表明QY-1的粗提物對神經(jīng)細胞的氧化損傷具有較好的保護效果，在1 000 μg/mL濃度時，細胞存活率提高了63.6%(圖2A)，但是在2 000 μg/mL時，保護作用卻大幅下降，這一方面說明QY-1的粗提物對真核細胞同樣具有抗氧化作用，另一方面也反映了對大腸埃希菌細胞和神經(jīng)細胞而言所需求的最佳濃度不一致。

為了明確QY-1的粗提物對神經(jīng)細胞抗氧化保護的可能機理，測定了其在氧化損傷狀態(tài)下乳酸脫氫酶(LDH)的酶活。LDH是評價細胞膜完整性的重要指標(biāo)，氧化損傷將導(dǎo)致LDH從細胞內(nèi)滲漏到細胞液中[13]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，800 μmol/L的H2O2處理將會嚴(yán)重破壞神經(jīng)細胞膜的完整性，使得LDH滲漏到細胞液的漏出率達正常細胞的12倍(圖2B)，但是在添加QY-1的粗提物后，這種滲漏作用得到有效緩解，與經(jīng)H2O2刺激過的細胞相比，LDH滲透率降低了81.5%，說明QY-1可以降低因H2O2導(dǎo)致的細胞膜損傷，從而起到保護神經(jīng)細胞的作用(圖2B)。

圖2 QY-1的粗提物對神經(jīng)細胞SH-SY5Y的氧化損傷保護Fig.2 Protective effects of QY-1 crude extract to nerve cells SH-SY5Y undergoing oxidative damageA：QY-1的粗提物對H2O2存在下神經(jīng)細胞生長的影響；B：QY-1的粗提物對神經(jīng)細胞LDH滲漏率影響；a、b、c表示Dumcan法測定的顯著性差異(P<0.05)，3次重復(fù)A: The growth influence of nerve cells to QY-1 crude extract under H2O2 stress; B: LDH leakage rate affected by QY-1 crude extract; a, b and c means significant difference by Duncan test with P<0.05, n=3

2.4 QY-1的主成分分離及對神經(jīng)細胞的抗氧化保護作用

將所獲得的QY-1 粗提物用甲醇溶解，薄層色譜后分離得到一主要物質(zhì)，命名為SF2(圖3A)，物質(zhì)結(jié)構(gòu)正在鑒定中。為了尋找到合適的藥物濃度范圍，先將上述單體配制成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，處理SH-SY5Y細胞24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，添加800 μmol/L的H2O2溶液繼續(xù)處理8 h，用MTT法測定細胞存活率。結(jié)果表明25～100 μg/mL的SF2傷害最小(表3)，選擇該濃度進行抗氧化保護作用分析。在25 μg/mL時對神經(jīng)細胞的氧化損傷具有較好的效果(表3)，將神經(jīng)細胞在H2O2脅迫下的相對存活率提高了58.6%。

表3 SF2對神經(jīng)細胞的毒性及抗氧化保護作用

注：*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01, n=3)；“-”表示未測定

為進一步分析SF2對神經(jīng)細胞氧化損傷的保護作用機理，實驗分別測定了SH-SY5Y細胞在SF2 6.25 μg/mL處理下的LDH、SOD、Caspase 3、Caspase 9的酶活表達情況。當(dāng)神經(jīng)細胞受到H2O2氧化損傷后，LDH滲出率升高、SOD酶活降低、凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9活性增高(圖3)。雖然SF2對降低細胞的LDH滲漏率、保護細胞膜完整性作用并不明顯(圖3B)，對SOD抗氧化酶的酶活增加也不顯著(圖3C)，但是SF2卻可以極顯著地抑制凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表達(圖3D、E)，說明SF2可能通過抑制凋亡蛋白的表達來實現(xiàn)對神經(jīng)細胞的抗氧化保護作用。

圖3 SF2的分離及對神經(jīng)細胞抗氧化保護作用的可能機理Fig.3 Isolation of SF2 and the possible mechanism to nerve cells in antioxidant protectionA: SF2的分離；B：LDH滲出率；C：SOD酶活；D：Caspase 3酶活；E：Caspase 9酶活；**表示極顯著差異P<0.01, n=3A: Isolation of SF2; B: LDH leakage rate; C: SOD enzyme activity; D: Caspase 3 enzyme activity; E: Caspase 9 enzyme activity; ** means very significant difference with P<0.01, n=3

3 討 論

近年來，植物內(nèi)生真菌成為一種新型天然藥物的重要來源[1-2]。本研究從能耐受低氧脅迫的植物疏花水柏枝一株具高抗氧化活性的內(nèi)生真菌QY-1為研究對象，對其進行了生物學(xué)鑒定和抗氧化能力分析。結(jié)果表明QY-1是一株球毛殼菌，而且不管在胞外還是胞內(nèi)，都表現(xiàn)出很高的抗氧化水平。其粗提物可保護神經(jīng)細胞膜的完整性，減低乳酸脫氫酶的滲漏率。從粗提物中分離到一種主成分SF2，可有效抑制H2O2脅迫下凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的活性，這一系列研究結(jié)果表明，球毛殼菌QY-1具備較強的抗氧化能力，是一種具有潛在開發(fā)價值的抗氧化劑資源。

隨著社會生活的進步，人類對新型抗氧化劑的研發(fā)提出了更多要求，越來越多的抗氧化劑用在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[9-10]。但是當(dāng)前還沒有一種通行的標(biāo)準(zhǔn)方法來準(zhǔn)確評價物質(zhì)的抗氧化能力，不同的方法可能有其局限性，導(dǎo)致實驗誤差較大[9-10]。限制了抗氧化研究的進一步發(fā)展。本研究結(jié)合3種體外測定方法和2種體內(nèi)測定方法來評價抗氧化活性，取得了較好的效果，也進一步證實了QY-1的高抗氧化能力。

我們發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細胞遭受H2O2氧化損傷后，凋亡蛋白Caspase 3活性的增強程度明顯高于Caspase 9，暗示Caspase 3在神經(jīng)細胞氧化損傷時發(fā)揮著更大的作用。QY-1生產(chǎn)的主物質(zhì)SF2，既可抑制Caspase 3，又可抑制Caspase 9的活性，暗示SF2可能通過抑制Caspase 3的活性來達到抗氧化保護作用，而可能通過抑制Caspase 3和Caspase 9的活性來達到促進細胞增殖的效果。

在分類學(xué)上，球毛殼菌屬于子囊菌亞門(Aseomyeotina)、球殼目(Sphaeriales)、黑孢殼科 (Melanosporaceae) 和毛殼菌屬(Chaetomium)[14]，是一種應(yīng)用極為廣泛的生防菌[15]。研究表明，球毛殼菌可通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[16]、競爭性抑制植物病原菌的生長[17]、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[18]等作用。本實驗室也發(fā)現(xiàn)QY-1可以有效抑制柑橘橘青霉(Penicilliumcitrinum)的生長，從而達到柑橘生物保鮮的效果[19]。球毛殼菌是否通過產(chǎn)生高抗氧化物質(zhì)來誘導(dǎo)物種發(fā)生氧化爆發(fā)從而起到光譜抗性，將是未來極有意義的一個研究方向。

本研究通過QY-1的提取分離，獲得了一種主成分SF2，對神經(jīng)細胞的氧化損傷起到一定的保護效果。但是值得說明的是，QY-1的粗提物與主成分SF2的作用機理是不一致的，如粗提物可以明顯抑制LDH滲漏到胞質(zhì)，可是SF2卻喪失了此能力，說明在QY-1的粗提物中還存在一些其他的抗氧化物質(zhì)。未來的實驗一方面要進行SF2鑒定，另一方面需進一步明確QY-1起抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，根據(jù)活性跟蹤的方法獲得高抗氧化活性的化合物，為進一步研發(fā)新型抗氧化劑提供參考。

[1] García A, Rhoden S A, Rubin Filho C J, et al. Diversity of foliar endophytic fungi from the medicinal plantSapindussaponariaL. and their localization by scanning electron microscopy [J]. Biological Research, 2012, 45(2): 139-148.

[2] Venugopalan A, Srivastava S. Endophytes asinvitroproduction platforms of high value plant secondary metabolites [J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6): 873-877.

[3] Tian W, Bi Y H, Zeng W, et al. Diversity of endophytic fungi ofMyricarialaxifloragrown under pre-and post-flooding conditions [J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(3): 10849-10862.

[4] 張陽, 李瑞蓮, 張德勝, 等. 澇漬對植物影響研究進展[J]. 作物研究, 2011, 25(2): 420-424.

[5] 田偉, 畢玉婷, 周啟龍, 等. 沒食子酸酯對神經(jīng)細胞的抗氧化保護作用研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(10): 1423-1427.

[6] Zeng W, Qin W, Tian W, et al. Antioxidant activity in vitro of endophytic fungi fromMyricarialaxiflora, a riparian plant with strong tolerance ability of flooding [J]. Journal of Pure and Applied Microbiology, 2015, 9(1): 87-95.

[7] 高媛, 雷旗, 蔣維, 等. 一株高抗氧化活性內(nèi)生真菌的分子鑒定及產(chǎn)酚酸類物質(zhì)研究[J]. 微生物學(xué)通報, 2016, 43(6): 1235-1243.

[8] Huang S L, He H B, Zou K, et al. Protective effect of tomatine against hydrogen peroxide-induced neurotoxicity in neuroblastoma (SH-SY5Y) cells[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2014, 66(6): 844-854.

[9] Prior R L, Wu X L, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(10): 4290-4302.

[10] Valavanidis A, Nisiotou C, Papageorgiou Y, et al. Comparison of the radical scavenging potential of polar and lipidic fractions of olive oil and other vegetable oils under normal conditions and after thermal treatment[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52:2358-2365.

[11] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1979: 90-121.

[12] 高強. 青檀內(nèi)生真菌球毛殼菌的抗氧化活性和發(fā)酵產(chǎn)物的研究[D]. 南京, 南京：師范大學(xué), 2013.

[13] Speen A, Jones C, Patel R， et al. Mechanisms of CDDO-imidazolide-mediated cytoprotection against acrolein-induced neurocytotoxicity in SH-SY5Y cells and primary human astrocytes[J]. Toxicology Letters, 2015, 238(1): 32-42.

[14] 葉麗丹, 勞佳萍, 盧建平, 等. 球毛殼菌熒光標(biāo)記與重寄生現(xiàn)象研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報, 2007, 33(2): 119-124.

[15] Park J H, Choi G J, Jang KS, et al. Antifungal activity against plant pathogenic fungi of chaetoviridins isolated fromChaetomiumglobosum[J]. FEMS microbiology letters, 2005,252(2): 309-313.

[16] 遲玉杰, 楊謙. 毛殼菌對植物病害的生物防治及存在的問題[J]. 農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究, 2002, 18(3): 215-218.

[17] 印敬明, 劉曉光, 萬慧, 等. 螺旋毛殼 (Chaetomiumspirale) ND35防病促生作用初探[J].萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2007, 23 (4): 272-275.

[18] 高廣增. 球毛殼ND35菌株的促生,抗病和抗旱作用及機制初探[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[19] 孔玉珊，秦田明，薛艷紅，等. 疏花水柏枝內(nèi)生真菌對三峽地區(qū)柑橘致腐菌的拮抗作用研究[J].食品工業(yè)科技，2015, 36 (8):175-177.