內(nèi)生真菌與大花紅景天互作的RAPD標(biāo)記分析

崔晉龍， 任曉琳， 王夢亮

(山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006)

紅景天為高山植物，生長海拔超過2 000 m[1]，隸屬于景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)，是中華人民共和國藥典收錄的藥食兼用的適應(yīng)原性植物藥[2]，功能主治為“益氣活血，通脈平喘，用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風(fēng)偏癱，倦怠氣喘”[3]。現(xiàn)代研究表明，它具有抗疲勞、抗氧化、抗輻射等生理活性[1]，具有強(qiáng)烈的適應(yīng)原性，大量使用故在醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)。全球大約分布96個(gè)紅景天品種，我國超過70種，是主要生產(chǎn)國和消費(fèi)國[4]。我國藥典只收錄了生長于青藏高原地帶的大花紅景天(R.crenulata)為藥用基源植物，其他各地紅景天品質(zhì)多有不同，影響其品質(zhì)的因素除了傳統(tǒng)的環(huán)境和地域原因外，內(nèi)生菌對植物尤其對特殊地域植物的代謝和發(fā)育也起著重要作用[5]。闡明內(nèi)生菌與紅景天相互作用機(jī)理，對于評價(jià)和深入開發(fā)紅景天資源具有重要意義。 RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA)分子標(biāo)記方法，能從分子水平對植物的遺傳變異程度進(jìn)行標(biāo)示和鑒別，具有精確、可靠、多樣性高等優(yōu)點(diǎn)[6]。菌株ZPRs-R-11分離自紅景天根部，具有促進(jìn)大花紅景天積累活性成分紅景天苷和酪醇[7]，并保持紅景天在實(shí)驗(yàn)室條件下健康生長的菌株。本研究旨在采用RAPD分子標(biāo)記法，對ZPRs-R-11接種紅景天之后，對紅景天不同時(shí)間條件下的遺傳性狀變化進(jìn)行標(biāo)記研究，以研究內(nèi)生真菌對宿主DNA遺傳水平的影響。這將對完善藥材道地性觀點(diǎn)、提高內(nèi)生菌是藥材品質(zhì)重要影響因素的認(rèn)識提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 內(nèi)生真菌ZPRs-R-11篩選自我國東北長白山的庫頁紅景天(R.sachalinensis)，鑒定為粉粒座孢屬(Trimmatostromasp.)真菌[7]，GenBank庫編號為KJ542345。保藏于山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所生物化工實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 紅景天組培苗 本課題組于2012年9月以西藏野生大花紅景天(R.crenulata)為基礎(chǔ)建立的組培苗繁殖體系[8]。

1.1.3 主要試劑 實(shí)驗(yàn)中所用的EasyTaqPCR SuperMix, 100 bp DNA Ladder等試劑由北京全式金生物技術(shù)公司提供；其他試劑及RAPD引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌接種組培苗 無菌條件下，打取直徑為0.5 cm的ZPRs-R-11菌餅，各取3塊均勻接種于組培苗生長的組培培養(yǎng)基上(菌面朝下)，并與組培苗基部緊密接觸。菌苗互作植株共培養(yǎng)條件：光14 h/暗10 h；對應(yīng)溫度28 ℃/22 ℃；濕度70～75% RH；光照強(qiáng)度30 μmol/m2/s?；钚跃c組培苗基部真正開始接觸時(shí)計(jì)為第1天，培養(yǎng)周期為15 d，每天取樣，共15批。以獨(dú)立培養(yǎng)生長的ZPRs-R-11以及大花紅景天組培苗作為對照。

1.2.2 共生苗中內(nèi)生真菌的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證接種真菌ZPRs-R-11與大花紅景天相互作用的真實(shí)性，采用兩種方法分別檢驗(yàn)：①采用石蠟切片法，對每個(gè)批次接種苗進(jìn)行顯微觀察，證明接入真菌的有效性；②對接種苗進(jìn)行菌種再分離，對于優(yōu)勢菌種進(jìn)行ITS序列測序，與原接入真菌進(jìn)行序列比對，以保證接入真菌為優(yōu)勢真菌。

1.2.3 DNA的提取及檢測 植物總DNA的提取采用CTAB法[9]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 RAPD-PCR反應(yīng)體系 經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]及預(yù)試驗(yàn)，選取12條RAPD引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為EasyTaqPCR SuperMix 7 μL(2 mmol/L Mg2+)，引物0.6 μmol/L，模板DNA 70 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.5 結(jié)果檢測及數(shù)據(jù)分析 對RAPD標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行1.5%凝膠電泳檢測，上樣5 μL，電壓120 V，拍照。同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中遷移率相同的條帶被認(rèn)為是同源性的。以8 000 bp DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，對樣品的RAPD電泳條帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將電泳圖譜上清晰且穩(wěn)定的條帶賦值為“1”，無條帶或弱帶的賦值為“0”，形成0/1矩陣。假設(shè)分析對象均符合Hardy-Weinberg平衡，用軟件PopGene 32[12]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(TPPB)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(HT)、Shannon多樣性指數(shù)(I)等。采用 NTSYS-pc2.10e[13]軟件對 Nei′s 遺傳距離進(jìn)行UPGMA(unweight pair-group method with arithmetic average)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZPRs-R-11與組培苗共生15 d的 RAPD多樣性分析

12條RAPD引物共擴(kuò)增出87條條帶，多態(tài)性條帶73條，多態(tài)性百分比為83.91%。每條引物平均擴(kuò)增7.25條帶，擴(kuò)增片段長度在100～8 000 bp間，由此可看出菌苗互作后的擴(kuò)增結(jié)果與對照組相比有新的條帶出現(xiàn)或原有條帶消失，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 引物R2(A)、R10(B)對紅景天的RAPD-PCR結(jié)果示意圖Fig.1 Amplification electrophorogram of RAPD Primers R2(A) and R10(B)0～15依次為菌苗互作的天數(shù)；J為內(nèi)生真菌ZPRs-R-11；M：Marker0～15 refers to the number of days for vaccine interactions; J refers to endophytic fungi；M：Marker

ZPRs-R-11與組培大花紅景天共生15 d的樣品及兩個(gè)對照組的Nei′s遺傳距離(D)和遺傳一致度(J)由PopGene32軟件計(jì)算，結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)顯示，D在0.273 7～1.064 7之間，J在0.344 8～0.760 6之間。遺傳距離最近的是菌苗互作樣品與無菌培養(yǎng)的組培苗(D=0.273 7,J=0.760 6)，遺傳距離最遠(yuǎn)的是真菌ZPRs-R-11與無菌組培苗(D=1.064 7,J=0.344 8)。

表1 基于RAPD的紅景天組培苗與ZPRs-R-11互作后遺傳一致度(加黑數(shù)字)和遺傳距離

注：****表示同種組織交駐，無需計(jì)算

通過PopGene32軟件同樣可以得出種群總基因多樣性(H)為0.355 7，組培大花紅景天與接種ZPRs-R-11組培苗之間的基因流Nm=0.209 8<1，說明菌-苗互作后真菌與宿主植物發(fā)生了一定程度的遺傳交換，但交換率較低。

2.2 ZPRs-R-11與組培苗共生15 d基于RAPD的聚類分析

根據(jù)RAPD擴(kuò)增結(jié)果得出的0/1矩陣，經(jīng)過NTSYS2.10軟件計(jì)算得出17個(gè)樣品間的聚類結(jié)果，見圖2。由圖2可以看出當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.740 0時(shí)，17個(gè)樣品可以聚為三大類：第I大類包括對照組無菌大花紅景天及ZPRs-R-11與組培苗的互作1～5 d后的紅景天組培苗；第II大類包括ZPRs-R-11與組培苗的互作6～10 d后的紅景天組培苗；第III大類包括ZPRs-R-11與組培苗的互作11～15 d后的紅景天組培苗及對照組ZPRs-R-11真菌。

圖2 ZPRs-R-11與組培苗互作后RAPD聚類圖Fig.2 Dendrograms of cluster for R. crenulata inoculated with ZPRs-R-11 based on RAPD molecular markers

2.3 接種的真實(shí)性驗(yàn)證

將內(nèi)生真菌接入大花紅景天后，采用石蠟切片法分別對采集的樣品進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果顯示，在未接種的組培苗中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的真菌菌絲，見圖3A。接種后，菌絲逐步侵入表皮并繁殖。其后的15 d中分別可以觀察到真菌菌絲侵入紅景天組織，未造成紅景天細(xì)胞的破裂，共生良好。圖3B和C分別是真菌侵染第3天和9天時(shí)紅景天內(nèi)部組織結(jié)果示意圖，表明真菌接入有效。同時(shí)，對采集材料進(jìn)行可培養(yǎng)真菌分離、純化，結(jié)果表明，未接種組培苗材料分離不到ZPRs-R-11為優(yōu)勢菌種的真菌群，而在不同時(shí)間段接種的紅景天材料中分別分離到以ZPRs-R-11為優(yōu)勢真菌的真菌群。優(yōu)勢真菌的ITS序列和接入真菌比對率為100%，系同一真菌，其ITS序列見GenBank庫，序號為KJ542345。說明實(shí)驗(yàn)過程真實(shí)有效。

圖3 真菌ZPRs-R-11侵入真菌的石蠟切片顯微結(jié)果示意圖Fig.3 The results of endophytic fungus ZPRs-R-11 was inoculated on R. crenulata observed under microscope A、B、C分別為對照、侵入3天、侵入9天時(shí)的顯微觀察結(jié)果，箭頭所指為真菌侵入植物細(xì)胞和組織的可見菌絲A，B，C are the results of control,the 3rd and 9th day of fungal invation,respectively;the hyphae in cell and tissue invaded by inoculating fungus were marked by arrow

3 討 論

本研究中使用的內(nèi)生真菌ZPRs-R-11是前期研究[7]中通過抗氧化活性篩選，獲得的與紅景天具有相同生物活性的優(yōu)勢菌株，與宿主具有種屬專一性和功能專一性。為了驗(yàn)證真菌對宿主遺傳性狀影響的可靠性，本研究結(jié)果表明內(nèi)生真菌ZPRs-R-11接種于宿主植物R.crenulata，能夠引起宿主DNA遺傳性狀的改變；隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌苗互作后組培苗與內(nèi)生真菌之間的遺傳相似系數(shù)變大；反之，與無菌組培苗之間的遺傳相似系數(shù)變小。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是真菌作為“誘導(dǎo)子”誘導(dǎo)植物基因水平發(fā)生變化，或者真菌與宿主植物之間發(fā)生了“橫向基因轉(zhuǎn)移”等現(xiàn)象，導(dǎo)致宿主紅景天遺傳性狀的改變這為下一步著手確定具體的遺傳改變、以及應(yīng)用ZPRs-R-11改良宿主表型特征提供了研究依據(jù)。

內(nèi)生真菌與宿主的互作關(guān)系已經(jīng)成為植物代謝和發(fā)育影響因素的重要研究方向[14]，研究表明，內(nèi)生菌與宿主之間存在著緊密的信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控、營養(yǎng)交換等互作機(jī)制[15-16]，本研究對內(nèi)生真菌與宿主不同共生時(shí)期的遺傳性狀差異表達(dá)進(jìn)行標(biāo)記，對了解不同植物-真菌相互關(guān)系的異同、改良植物品質(zhì)、品質(zhì)監(jiān)控等都具有參考價(jià)值,也為進(jìn)一步闡明植物真菌互作的分子機(jī)制提供依據(jù)。

[1] Han F, Li YT, Mao XJ, et al. Characterization of chemical constituents inRhodiolacrenulataby high-performance liquid chromatography coupled with Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometer (HPLC-FT-ICR MS)[J]. J Mass Spectrom, 2016, 51(5): 363-368.

[2] Ma CY, Tang J, Wang HX, et al. Simultaneous determination of six active compoundsinRhodiolaL. by RP-LC[J]. Chromatographia, 2008, 67(5): 383-388.

[3] 國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 144.

[4] Panossian A, Wikman G, Sarris J. Rosenroot (Rhodiolarosea): traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical efficacy[J]. Phytomedicine, 2010, 17(7): 481-493.

[5] Wani ZA, Ashraf N, Mohiuddin T, et al. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective[J]. Appl Microbiol Biot, 2015, 99(7): 2955-2965.

[6] Kumar H, Priya P, Singh N, et al. RAPD and ISSR marker-based comparative evaluation of genetic diversity among Indian germplasms ofEuryaleferox: an aquatic food plant[J]. Appl Microbiol Biot, 2016, online. Doi:10.1007/s12010-016-2171-z.

[7] Jinlong C, Tingting G, Zhenxing R, et al. Diversity and antioxidant activity of culturable endophytic fungi from alpine plants ofRhodiolacrenulata,R.angusta, andR.sachalinensis[J]. Plos one, 2015, 10(3):e0118204.

[8] 王夢亮，張娜莎，郭婷，等. 植物生長物質(zhì)對大花紅景天愈傷組織誘導(dǎo)及苗再生的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014, 50(2): 192-196.

[9] Huanca MW, Rivera CD, Maita MJ. A simple, fast, and inexpensive CTAB-PVP-silica based method for genomic DNA isolation from single, small insect larvae and pupae[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(3): 8001-8007.

[10] 虞泓, 朱榮勛, 李永誼, 等. 云南常見藥用紅景天的 RAPD 分析[J]. 中草藥, 2005, 36(1): 96-99.

[11] 王夢亮，任曉琳，崔晉龍，等. 野生紅景天的RAPD和ISSR遺傳多樣性分析[J]. 中草藥, 2016, 47(3):469-473.

[12] Rohlf FJ. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 2.2[M]. New York : Applied Biostatistics Inc, 2009: 1-43.

[13] Yeh FC, Boyle TJB. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits[J]. Belg J Bot, 1997, 129: 157-163.

[14] Rodriguez RJ, White JF, Arnold AE, et al. Fungal endophytes: diversity and functional roles[J]. New Phytol, 2009, 182:314-330.

[15] Sanchez-Azofeifa A, Oki Y, Fernandes GW, et al. Relationships between endophyte diversity and leaf optical properties[J]. Trees, 2012, 26:291-299.

[16] Coutinho BG, Licastro D, Mendonca PL, et al. Plant-influenced gene expression in the rice endophyteBurkholderiakururiensisM130[J]. Mol Plant In, 2015, 28(1): 10-21.