激酶組學在原核生物中的研究進展

薛 闖， 張 萌， 陳麗杰

(大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116023)

激酶組學(kinomics)主要用于研究激酶的豐度、活性、底物特異性、磷酸化狀態(tài)等特性。蛋白激酶(protein kinase)是指能夠使蛋白質發(fā)生磷酸化的一類酶，蛋白激酶出現在大多數真核細胞的信號轉導過程，同時也可以控制代謝、轉錄、細胞周期調控、細胞凋亡、運動、分化等其他細胞進程[1]。蛋白質磷酸化是一種常見并且非常重要的蛋白質翻譯后修飾(PTM)形式，20世紀50年代首先發(fā)現可逆的磷酸化能夠調節(jié)糖原磷酸化酶的活性，此后對蛋白質磷酸化調控細胞進程的研究逐漸增多。目前對真核生物的激酶組學研究比較透徹，在人類激酶組的鑒定中發(fā)現有518個蛋白激酶，通過染色體定位等手段發(fā)現有244個激酶與疾病的發(fā)生有關[2]。有研究顯示，在真核生物中，超過30%的蛋白質在任何時刻都在發(fā)生磷酸化進程[3]。其中激酶磷酸化出現最多的有兩種形式：一種為絲氨酸/蘇氨酸激酶使蛋白質上絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，由Hanks等人首先發(fā)現，也被稱為Hanks家族激酶[4]；另一種為酪氨酸激酶使自身酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，在20世紀80年代早期被發(fā)現。在真核生物中絲氨酸磷酸化、蘇氨酸磷酸化、酪氨酸磷酸化發(fā)生的比例分別約為86.4%、11.8%、1.8%[6]。 最初，人們認為蛋白質磷酸化只在真核生物中出現，原核生物蛋白質磷酸化的研究比真核生物晚。20世紀90年代，科學家在原核生物中發(fā)現蛋白激酶也能夠起到蛋白質磷酸化的作用。在原核生物中最常見的一類激酶為組氨酸激酶，它出現在雙組分信號轉導系統(tǒng)(TCS)中，能夠使自身的組氨酸殘基和其下游響應蛋白的天冬氨酸殘基發(fā)生磷酸化。而真核生物中經常出現的三類蛋白激酶磷酸化在原核生物的研究中相對較少。

1 絲氨酸/蘇氨酸激酶在原核生物中的研究進展

1.1 研究歷史

在原核生物中首先發(fā)現的被絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化的酶是大腸埃希菌(Escherichiacoli)中的異檸檬酸脫氫酶，它的絲氨酸位點被在真核生物中缺少絲氨酸/蘇氨酸激酶同源性的一個雙功能激酶/磷酸酶磷酸化。第一個在細菌中被確定與真核生物中絲氨酸/蘇氨酸激酶有同源性關系的激酶是黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)中的Pkn1激酶[6]，編碼該激酶的基因pkn1在大腸埃希菌中過表達后會在絲氨酸/蘇氨酸位點上發(fā)生自磷酸化，而在黃色粘球菌中敲除pkn1基因則會使細胞分化進程提前，說明該激酶在黃色粘球菌的發(fā)育中起到重要作用。原核生物基因組測序的完成，基因組序列的獲得能夠發(fā)現更多的絲氨酸/蘇氨酸激酶，越來越多激酶的確定為研究絲氨酸/蘇氨酸激酶在原核生物的細胞發(fā)育和代謝調控等方面提供了支撐[7]。

1.2 絲氨酸/蘇氨酸激酶的功能

1.2.1 調控細菌孢子化進程 孢子化是機體響應外界壓力或營養(yǎng)源限制啟動的進程，孢子化進程受到一系列蛋白質磷酸化事件調控。在枯草芽胞桿菌中，轉錄因子Spo0A的活化能夠啟動孢子化進程，它通過組氨酸激酶磷酸化作用使自身發(fā)生磷酸化并活化，這類磷酸化易失活且不穩(wěn)定[8]。最近發(fā)現另一類比組氨酸激酶磷酸化更穩(wěn)定的磷酸化形式：Hanks家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶使蛋白質上的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，這類磷酸化形式在孢子化進程中扮演重要角色。在枯草芽胞桿菌中，一共有四種絲氨酸/蘇氨酸激酶：PrkA、PrkC、PrkD和YabT，除了PrkD外，其他三個激酶均在孢子化的不同階段發(fā)揮重要作用[9]，圖1為三個激酶在調節(jié)孢子化過程中的作用方式。在孢子化起始過程中PrkA和YabT的基因表達量明顯增多。PrkA擁有一個催化域，定位在前孢子膜上，在枯草芽胞桿菌中檢測到絲氨酸/蘇氨酸激酶PrkA能夠磷酸化一個60 kDa未知蛋白上的絲氨酸位點，但未檢測到自磷酸化現象[10]。YabT包含三個結構域：跨膜區(qū)、激酶區(qū)和DNA結合區(qū)，通過將YabT結合到DNA結合區(qū)，能夠活化其激酶活性[11]。成熟的孢子從母體釋放成為休眠體，休眠體代謝能力明顯下調，這受到伸長因子Tu(EF-Tu)磷酸化的調控，而在yabT突變體中不能檢測到EF-Tu磷酸化，這也能夠證明絲氨酸/蘇氨酸激酶YabT調控EF-Tu的磷酸化，進而調控休眠過程。PrkC是一個跨膜蛋白，包括一個內部催化域和外部調控C末端區(qū)域。當外界條件適宜生長時，絲氨酸/蘇氨酸激酶PrkC通過結合生長細胞釋放的胞壁肽進而誘導休眠細胞的再生[12]。因此，枯草芽胞桿菌中的三種絲氨酸/蘇氨酸激酶均在孢子化進程中起到重要作用。目前在梭菌中還未見關于絲氨酸/蘇氨酸激酶的研究報道。但是梭菌和芽胞桿菌中的很多基因和蛋白有高度同源性，它們在菌株中有著相同或相似的功能。例如，絲氨酸/蘇氨酸激酶如PrkA、組氨酸激酶HKs、轉錄調控因子Spo0A和σ、延伸因子EF-Tu/G和重組酶RecA等在丙丁梭菌和枯草芽胞桿菌中同時存在。并且，已有的研究報道證實兩種菌株中的組氨酸激酶HKs、轉錄調控因子Spo0A和σ在群體效應、磷酸轉移和下游蛋白/基因調控均發(fā)揮相同或相似的作用[13-14]。因此，絲氨酸/蘇氨酸激酶在梭菌中可能發(fā)揮著芽胞桿菌中類似的功能。

圖1 調節(jié)孢子化進程三種絲氨酸/蘇氨酸激酶作用方式Fig.1 The regulation of the three serine/threonine kinases in the process of sporulationA：孢子化進程中PrkA和YabT激酶磷酸化作用；B：休眠孢子活化過程，PrkC激酶起到關鍵作用A:The phosphorylation of PrkA and YabT kinase in the process of sporulation;B:The key role of PrkC kinase in activation of dormancy spores

1.2.2 調控次級代謝進程 絲氨酸/蘇氨酸激酶在調控原核細菌次級代謝產物方面起到重要作用。鏈霉菌為革蘭陽性絲狀菌，它有復雜的形態(tài)學分化并且能合成臨床相關抗生素等小分子。放線菌紫素由天藍色鏈霉菌在絲氨酸/蘇氨酸激酶AfsK的調控下合成[15]。AfsK可以在體外對蛋白AfsR上的絲氨酸/蘇氨酸殘基進行磷酸化，afsK基因突變的菌株中無法產生放線菌紫素。同時，在afsR下游編碼一個與次級代謝相關的蛋白轉錄子afsS在afsK突變體中的表達也出現了延遲。AfsK磷酸化增強了afsS啟動子的啟動和AfsR蛋白的ATP水解酶的活性，進而促進afsS的表達，增加放線菌紫素的產量[16]。KbpA蛋白與非磷酸化形式的AfsK激酶相互結合，抑制激酶的自磷酸化，進而促進活化[17]。KbpA編碼區(qū)在afsK基因上游，afsK的轉錄能夠增加放線菌紫素的產量，進而證明KbpA通過調控AfsK的活性控制其次級代謝的產量，也能夠說明激酶在調控次級代謝進程中起到重要作用。

1.2.3 調控細胞分裂和細胞形態(tài) 很多實驗已經證明絲氨酸/蘇氨酸激酶能夠調控細胞分裂或細胞形態(tài)。細菌的操縱子通常包含功能性相關基因，在細胞分裂中細胞形態(tài)和基因的順序建立了良好的關系。例如，在分枝桿菌(M.tuberculosis)中，絲氨酸/蘇氨酸激酶PknA和PknB的操縱子中包含編碼青霉素結合蛋白A(PBPA)和RodA的基因， 因此這兩個激酶可控制細胞形態(tài)。pknA和pknB基因均在細胞生長指數期表達，它們過表達后會使細胞變長[18]。PknA能夠使一個真核細胞同源物、分裂隔的主要組成元件的微管蛋白FtsZ上的蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，PknB在大腸埃希菌中使PBPA的第362位和437位蘇氨酸發(fā)生磷酸化。因此，絲氨酸/蘇氨酸激酶在調控細胞分裂和細胞形態(tài)中起到重要作用。

2 酪氨酸激酶在原核生物中研究進展

2.1 研究歷史

在發(fā)現原核生物酪氨酸激酶前，細菌中的酪氨酸磷酸化已經在大腸埃希菌中被成功發(fā)現[19]，隨后在其他細菌中也發(fā)現了酪氨酸磷酸化，但無法確定這些酪氨酸磷酸化是通過核苷酸化產生還是蛋白質的磷酸化作用產生。后來的研究發(fā)現通過單克隆抗體等實驗技術在青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)中能夠檢測到酪氨酸磷酸化[20]。第一個確定的酪氨酸激酶是在約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)中發(fā)現，該蛋白激酶Ptk位于細胞內膜，長為82 kDa，它能夠使該蛋白上多個酪氨酸位點發(fā)生自磷酸化[21]。Ptk蛋白包含兩段沃克A和B序列，這兩段序列在真核生物的酪氨酸激酶中常見，在原核生物中蛋白質的ATP結合也起到重要作用，通過研究發(fā)現使酪氨酸發(fā)生自磷酸化的蛋白激酶一般都具有沃克A和B序列，基于酪氨酸激酶在細菌中的特性，也被稱為BY(bacterial tyrosine)激酶。

2.2 細菌酪氨酸激酶結構和催化位點

細菌中的酪氨酸激酶包含一個跨膜區(qū)和細胞內催化域，這兩個區(qū)域通過一個多肽或者通過它們相互作用形成的螺旋連接[22]。革蘭陽性菌中的放線菌和厚壁菌門的酪氨酸激酶膜外部環(huán)與其他細菌相比序列具有高度的相似性，但是與革蘭陰性菌的變形菌門的酪氨酸激酶外部胞質環(huán)相比有一些不同。此外，在放線菌和厚壁菌門的酪氨酸激酶外部環(huán)更短一些[23]。

細菌中酪氨酸激酶的催化活性位點為沃克A(GXXGXGK[T/S])和沃克B(hhhhD)序列，有的蛋白也有沃克A′序列。沃克A′序列通常不會在核苷酸結合的蛋白中出現，但會出現在某些激酶磷酸化小分子底物中，如莽草酸或葡萄糖酸，這些小分子底物擁有一段退化的沃克B序列[24]。所有的酪氨酸激酶都能夠在C末端的位點上檢測到酪氨酸的自磷酸化，C末端的區(qū)域也為酪氨酸的聚類區(qū)域，該區(qū)域的七個酪氨酸都有可能被磷酸化。

2.3 細菌酪氨酸激酶功能

細菌酪氨酸激酶具有細胞代謝和基因水平上的調控功能。最初的研究發(fā)現BY激酶可能與細胞外多糖的合成有關，BY激酶通常編碼控制多糖聚合物合成的操縱子的基因[25]，在大腸埃希菌中鑒定到的BY激酶Etk，是莢膜多糖操縱子的組成部分之一[26]。其他蛋白也可以被BY激酶磷酸化，其中包括熱休克σ因子RpoH和RpoE[27]，這兩個σ因子在大腸埃希菌中控制兩個熱休克調控子的表達。通過突變rpoH基因使其不能發(fā)生磷酸化，進而得到一個對溫度敏感的表型；類似地，通過磷酸化RpoE的抑制子RseA，也能夠改變它對RpoE結合的親和力?？傊@些研究顯示BY激酶能夠調節(jié)熱休克蛋白的響應。

3 組氨酸激酶在原核生物中研究進展

3.1 雙組分信號轉導系統(tǒng)

組氨酸激酶主要存在于雙組分信號轉導系統(tǒng)(TCS)中，包括組氨酸激酶(Histidine kinase, HK)和調控響應蛋白(Response regulator, RR)[28]。雙組分信號轉導系統(tǒng)主要存在于細菌中，在部分真核生物中也被發(fā)現[29]。過去30年的研究中發(fā)現，TCS不僅僅作為簡單的刺激-響應調控體系，很多TCS都包括多個元件，內在或交叉聯(lián)系很多其他的調控循環(huán)。當檢測到外界環(huán)境變化(例如：鹽、溫度、營養(yǎng)物等)，表觀組氨酸激酶的結構域將會發(fā)生構象變化，觸發(fā)ATP介導一個保守的組氨酸殘基通過與ATP結合域直接相互作用的磷酸化，接下來磷酸基團會轉移到響應蛋白的天冬氨酸上，進一步調控下游基因的表達[30]。大多數雙組分系統(tǒng)有一個模塊化的架構組織，使它們能夠執(zhí)行復雜和靈活的監(jiān)管策略。雙組分信號轉導系統(tǒng)對于調控細菌重要的生存過程，例如代謝、群體效應、孢子化等起到重要作用[31]。雙組分信號轉導系統(tǒng)與許多細菌的致病性密切相關，使雙組分轉導系統(tǒng)蛋白成為治療靶點研究，例如TCS轉導被應用在肺炎、中毒性休克綜合征、肺結核以及其他急性和慢性感染疾病的研究中[32]。此外，這些修飾在多元化外界環(huán)境情況下信號系統(tǒng)會允許這些機體做出快速的改變。相反，哺乳動物細胞體系依賴于跨膜酪氨酸激酶作為外界刺激的回應，在這些細胞中對組氨酸激酶磷酸化的研究非常罕見[29]。

3.2 組氨酸激酶的功能

3.2.1 調控孢子化進程和溶劑產量 在丙丁梭菌(Clostridiumacetobutylicum)中發(fā)現組氨酸激酶能夠調控孢子化進程和溶劑產量。并且，由組氨酸激酶參與的細胞發(fā)育和代謝調控還可能與群體效應有關，與高密度細胞培養(yǎng)條件下的信號分子感應和轉導有關[33-34]。生物信息分析中發(fā)現在丙酮丁醇梭菌中有五種組氨酸激酶CA_C0323、CA_C0903、CA_C2730、CA_C0437、CA_C3319。Steiner和同事發(fā)現了基于上述五種組氨酸激酶的Spo0A磷酸化途徑[35]。第一條途徑僅依賴于組氨酸激酶CA_C0323，另一條途徑依賴于組氨酸激酶CA_C0903和CA_C3319，單獨突變編碼五種組氨酸激酶的基因發(fā)現孢子化頻率較親本菌株減少95%～99%，說明這些基因在孢子化中起到重要作用。此外，雙突變cac0323/0903和cac0323/3319基因導致細胞完全失去孢子化能力，cac0903/3319基因雙突變與基因單突變相比，只有部分孢子化形成的減少。體外也能夠檢測到激酶CA_C0323、CA_C0903、CA_C3319自磷酸化，Spo0A的磷酸基團在體外也可以發(fā)生轉移，激酶CA_C0903、CA_C3319都能夠成功自磷酸化并轉移Spo0A的磷酸基團，激酶CA_C0323并未檢測到自磷酸化的能力。Xu等[36]通過基因敲除技術敲除編碼組氨酸激酶的基因cac3319，將敲除菌和野生型分別進行批次發(fā)酵培養(yǎng)，敲除菌的丁醇產量達到18.2 g/L，與野生型相比丁醇產量提高了44.4%，實驗證明組氨酸激酶能夠調節(jié)細菌的產溶劑能力。研究表明，梭菌菌株的環(huán)境脅迫耐受能力是由多基因調控的復雜性狀，組氨酸激酶參與的細胞調控還有助于提高梭菌的環(huán)境脅迫耐受能力[37-38]。組氨酸激酶在梭菌細胞中對碳源代謝和脅迫耐性調節(jié)存在差異性，組氨酸激酶CA_C3319對目標產物丁醇的合成有正調控作用，而組氨酸激酶CA_C0437對丁醇合成起負調控作用。如果這些組氨酸激酶調控與在線發(fā)酵分離耦合解毒策略結合，將有利于提高梭菌或其它微生物生產代謝產物的效率[39-40]。

3.2.2 調節(jié)細菌趨化性 細菌趨化性(chemotaxis)是指有運動能力的細菌對有利環(huán)境的趨附和對有害環(huán)境的避離運動，而二元信號系統(tǒng)則是細菌實現這種功能的主要途徑。趨化途徑最初在大腸埃希菌和鼠傷寒沙門氏菌中被發(fā)現[41]。如圖2所示，當甲基化轉移酶CheR和甲基酯酶CheB發(fā)生甲基化或去甲基化時，細菌能感知到外界環(huán)境的信號。當接收到外界信號后，信息將被傳遞到趨化性組氨酸激酶CheA，通過其保守區(qū)域上一個位點的自磷酸化，將磷酸基團傳遞至下游響應蛋白CheY和CheB的天冬氨酸上。被磷酸化的CheY結合到鞭毛馬達上后，鞭毛的旋轉運動能夠發(fā)生改變，進而完成趨化過程。

圖2 趨化性組氨酸激酶磷酸轉移過程Fig.2 The phosphate transfer process of chemotaxis histidine kinaseCheA為趨化性組氨酸激酶，CheY和CheB為響應蛋白CheA is the chemotactic histidine kinase,CheY and CheB are the response proteins

4 激酶磷酸化的研究方法

前對激酶磷酸化的主要研究方法為富集磷酸化肽段，有很多方法能夠選擇性分離磷酸化肽段。包括：①使用絲氨酸/蘇氨酸特異性抗體進行免疫共沉淀富集磷酸化肽段，但該方法具有受抗體特異性限制和價格昂貴的缺點；②通過化學限制邁克爾加成和使用標簽來代替磷酸肽上的磷酸基團，但該方法需要較大的工作量，而且還具有由多步反應造成的樣品損失和不可避免的副反應增加樣品的復雜性等缺點；③與吸附劑發(fā)生相互作用，例如金屬氧化物TiO2、ZrO2、Al2O3，固定化金屬離子Fe3+、Ga3+、Ni2+、Zr4+，親和吸附IMAC和強離子交換色譜吸附[42]。在以上這些方法中，固定金屬離子親和色譜法(IMAC)是吸附磷酸化肽段的最好方法。質譜分析方法，特別是結合低能量碰撞誘導解離串聯(lián)質譜已經成為分析共價蛋白修飾的表征功能的工具，用于蛋白質磷酸化的分析和定量[43]。利用質譜分析的方法，磷酸化蛋白將被酶解為肽段，相關富集技術可以將磷酸化肽段選擇性分離出來，以避免非磷酸化肽段干擾分析。在質譜分析中，這些磷酸化肽段的序列和磷酸化位點會被鑒定出來。利用Maxcount和Mascot軟件，通過搜索對應蛋白組的數據庫，可以得到樣品中蛋白質組和磷酸化肽段的信息[44]。利用質譜能夠對絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶的磷酸化肽段進行成功檢測，平均每個細胞能夠檢測到100個磷酸化蛋白[6]。但組氨酸激酶的磷酸化不易檢測，因為組氨酸激酶催化的磷酸基團與氨基酸的結合鍵為P-N鍵，它在酸性條件下非常不穩(wěn)定而且豐度很低，在酸性條件下進行質譜分析會丟失組氨酸磷酸化肽段。有研究顯示，在49 ℃ 1 mol/L HCl存在的條件下，1-磷酸化組氨酸的半衰期為18 s，3-磷酸化組氨酸半衰期為25 s[45]。這也就意味著很多絲氨酸/蘇氨酸磷酸化檢測的技術不能應用到組氨酸磷酸化的研究上。因此，激酶的磷酸化研究需要借助質譜技術的發(fā)展不斷完善和進步。

5 總結與展望

在原核生物中，激酶類型主要以參與雙組分信號系統(tǒng)的組氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶為主，它們在細胞發(fā)育和代謝調控等方面起重要作用。目前關于原核生物尤其是工業(yè)微生物的代謝調控多局限于對代謝網絡基因的研究，而對由激酶主導的蛋白翻譯后修飾研究很少。由于這些激酶在細胞發(fā)育和代謝調控中起重要的作用，它們不僅可以作為基因工程菌株改造的新靶點，還是合成生物學中不可忽視的基因模塊。雖然質譜技術和組學分析技術在不斷發(fā)展，對絲氨酸/蘇氨酸激酶的檢測已形成較為成熟的技術，目前對組氨酸激酶的檢測仍存在很大難題，需要更有效的檢測技術。由于激酶在原核生物中的重要作用，相信越來越多的激酶在原核生物中被發(fā)現，它們的功能和調控機制將隨著激酶磷酸化檢測技術的革新不斷被深入挖掘和闡明。

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