卵胞漿內(nèi)單精子注射的精子優(yōu)選

汪彩珠 馮貴雪

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)助孕成功的關(guān)鍵是獲得有活力的胚胎。而胚胎的發(fā)育受卵子和精子質(zhì)量的影響。在早期胚胎的前2次分裂主要受母源基因調(diào)控，而當(dāng)胚胎發(fā)育到4～8細(xì)胞后，胚胎基因組激活，父源基因組開(kāi)始發(fā)揮作用，異常的精子可能降低后期胚胎發(fā)育潛能，從而影響臨床結(jié)局[1-2]。因此理論上，提高用于授精的精子質(zhì)量能提高ART助孕結(jié)局。

體外受精(in vitro fertilization,IVF)中的常規(guī)精子優(yōu)選方法僅限于精液洗滌中的密度梯度離心法和上游法。卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)中常規(guī)的精子優(yōu)選方法是基于精子活力和200倍或400倍鏡下精子大致形態(tài)進(jìn)行的選擇。然而，這些方法不能有效篩選出DNA完整的精子，事實(shí)上，形態(tài)正常的精子中DNA碎片仍然較高[3]。因此，從提高ART有效性和安全性角度出發(fā)，迫切需要新的精子優(yōu)選技術(shù)。為此，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于ICSI精子優(yōu)選的新方法進(jìn)行綜述分析。

一、精子膜表面電荷的選擇

成熟精子膜攜帶負(fù)電荷，基于這種表面電荷差異的精子優(yōu)選方法有微流小室電泳法和電動(dòng)電位法。Ainsworth等[4]首先提出利用微流小室電泳法能有效地分離出前向的、形態(tài)正常的、DNA損傷小的精子。最近，Luke等[5]改進(jìn)了微流電泳法，有效地分離出攜帶負(fù)電荷的健康精子，并認(rèn)為攜帶負(fù)電荷可作為健康精子的潛在生化標(biāo)記。精子電動(dòng)電位是精子膜和它周?chē)碾娢徊?，獲能的精子電動(dòng)電位更低?；诖?，Chan等[6]利用電動(dòng)電位法快速篩選出了形態(tài)正常、DNA完整、成熟的精子。Zahedi等[7]利用該方法也成功優(yōu)選出高比例的形態(tài)正常、DNA碎片低和魚(yú)精蛋白缺乏的精子。相比于微流小室電泳法，電動(dòng)電位法操作更簡(jiǎn)單，且不需要昂貴儀器，但是該方法精子回收率低，且不適用于從睪丸或附睪中獲取的精子。因此，依據(jù)精子膜表面電荷的上述兩種精子優(yōu)選方法，缺乏后續(xù)用于IVF或ICSI的妊娠結(jié)局的報(bào)道，也因各自的缺陷，目前尚未能在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

二、非凋亡精子的選擇

凋亡的精子DNA發(fā)生斷裂，影響胚胎的發(fā)育。因此，選擇非凋亡的精子理論上能提高臨床結(jié)局。ART中非凋亡精子的選擇是基于在凋亡早期階段，精子膜磷酯酰絲氨酸外顯化的特征進(jìn)行。常用的有磁性活化細(xì)胞分選法(magnetic-activated cell sorting,MACS)。這種方法是利用磷酯酰絲氨酸與膜聯(lián)蛋白V具有高度親和力的特征進(jìn)行凋亡與非凋亡精子的選擇。研究表明，利用膜聯(lián)蛋白V磁珠與凋亡精子結(jié)合的特性可以有效地從凍融精液中富集非凋亡精子[8]、形態(tài)正常的精子[9]，并且進(jìn)一步研究表明分離柱和磁珠對(duì)于精子功能沒(méi)有影響[8]。但也有研究表明MACS法富集的精子與上游法富集的精子質(zhì)量類(lèi)似[10]。Rawe等[11]利用MACS法對(duì)高凋亡比率的精液進(jìn)行優(yōu)選，然后進(jìn)行ICSI，獲得了良好妊娠結(jié)局。同樣，Herrero等[12]報(bào)道了一例2次ICSI治療失敗的男性癌癥患者，利用MACS法優(yōu)選復(fù)蘇的精液進(jìn)行ICSI，最終雙胎妊娠。這表明MACS法是一種能提高精液質(zhì)量的有潛力的篩選方法。但是該方法需要與密度梯度離心法結(jié)合使用，精子回收率低，不適用于嚴(yán)重少弱精子，并且部分精子可能攜帶磁珠，存在未知的安全隱患，阻礙了該方法的臨床推廣應(yīng)用。

三、透明質(zhì)酸結(jié)合法選擇

透明質(zhì)酸(hyaluronic-acid,HA)是卵冠丘胞外基質(zhì)的主要成分。精子質(zhì)膜上透明質(zhì)酸結(jié)合位點(diǎn)的形成是精子成熟的標(biāo)志。在正常受精過(guò)程中，成熟的精子依靠頭部HA結(jié)合位點(diǎn)與HA結(jié)合并消化HA，從而更好地穿過(guò)卵冠丘復(fù)合物與卵子結(jié)合，而不成熟精子則無(wú)法與HA結(jié)合。在體外，HA已作為成熟精子的生理選擇器。目前，可直接應(yīng)用的HA精子選擇體系有2種。一種是商業(yè)化的生理性卵胞漿內(nèi)單精子注射皿(physiological intracytoplasmic sperm injection,PICSI)即底部涂有HA的ICSI皿。另一種是含有HA的培養(yǎng)液(spermSlow)。兩種均是在ICSI時(shí)，選擇與HA粘附的精子進(jìn)行顯微注射。

關(guān)于HA優(yōu)選精子的報(bào)道較多。研究表明經(jīng)透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)優(yōu)選出的精子，凋亡標(biāo)記蛋白的比例顯著減少[13],DNA碎片和核異常比例顯著減少[14]，染色體非單倍體的比率也顯著降低[15]。但也有研究表明利用HA優(yōu)選出的精子DNA完整性與常規(guī)PVP中選擇的精子沒(méi)有區(qū)別[16]。而臨床研究則表明PICSI相比于常規(guī)ICSI，受精率、胚胎質(zhì)量、種植率、妊娠率和活產(chǎn)率都得到顯著提高，并且受精率與HA結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)[17]。但也有研究表明PICSI能提高受精率，對(duì)于妊娠率和種植率沒(méi)有影響[14]。HA結(jié)合法雖然能優(yōu)選出成熟的精子，但也存在可能將HA帶入卵母細(xì)胞中的不安全隱患。另外，最近一篇Meta分析表明目前尚沒(méi)有足夠證據(jù)支持在所有ICSI周期中應(yīng)用HA法進(jìn)行精子優(yōu)選[18]。

四、精子雙折射特性選擇

成熟的精子細(xì)胞核由于縱向定位的頂體下的蛋白纖維絲而具有較高的內(nèi)在雙折射特性。使用偏振光顯微鏡可以進(jìn)行精子雙折射特性的觀察，從而進(jìn)行成熟精子的選擇。研究表明精液中具有雙折射特性精子的比率與精液濃度、活率和活力相關(guān)[19]。對(duì)無(wú)前向運(yùn)動(dòng)和睪丸穿刺獲取的精液利用雙折射特性對(duì)精子進(jìn)行選擇后行ICSI，雖然受精率和卵裂率沒(méi)有差異，但顯著提高了臨床妊娠率、種植率和繼續(xù)妊娠率[19]。此外，利用雙折射特性可以篩選出已發(fā)生頂體反應(yīng)和未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，分別用這些精子進(jìn)行ICSI，結(jié)果表明兩組的受精率和胚胎質(zhì)量沒(méi)有區(qū)別，但是頂體反應(yīng)組的胚胎種植率顯著高于未反應(yīng)組[20]。最近的一篇研究也表明利用精子頭部的雙折射特性測(cè)量的光延遲值與臨床結(jié)局息息相關(guān)，臨床結(jié)局最佳的精子頭光延遲范圍為0.56 nm～0.91 nm[21]。雖然依據(jù)雙折射特性能優(yōu)選出成熟的精子，但有關(guān)其應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少，而對(duì)于后代的安全性則未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

五、超高倍鏡下精子形態(tài)選擇

細(xì)微的精子形態(tài)學(xué)差異(頂體、細(xì)胞核、線粒體、頂體后致密板和頸部)能通過(guò)超高倍顯微鏡(6 000×)觀察到，此技術(shù)稱(chēng)為MSOME(motile sperm organelle morphology examination )。通過(guò)此技術(shù)可以篩選出精子核、頂體后致密板、頂體、頸部及尾部都正常的精子。卵胞漿內(nèi)形態(tài)學(xué)選擇單精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection,IMSI)是MSOME方法在ICSI中的改進(jìn)應(yīng)用[22]。

Bartoov等[22]研究表明IMSI比常規(guī)ICSI能產(chǎn)生更高的妊娠率和抱孩率，但受精率、卵裂率則沒(méi)有明顯區(qū)別。隨后，Berkovitz等[23]通過(guò)大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)了IMSI能顯著提高臨床結(jié)局。一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)自身對(duì)照研究也表明[24]，對(duì)于精液質(zhì)量差、胚胎質(zhì)量差、多次ICSI失敗的患者，IMSI技術(shù)能提高胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局。尤其對(duì)于反復(fù)ICSI失敗的患者，IMSI技術(shù)能顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[25-26]。進(jìn)一步研究表明IMSI技術(shù)提高臨床結(jié)局的同時(shí)并沒(méi)有影響到胚胎的整倍性[27]。但是，另一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究則表明IMSI和ICSI技術(shù)對(duì)于患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率無(wú)顯著區(qū)別[28]。另外，由于IMSI技術(shù)操作時(shí)間長(zhǎng)且精子長(zhǎng)時(shí)間處在PVP中，可能會(huì)損傷精子。因?yàn)镻VP能引起精子膜的損傷和誘導(dǎo)頂體反應(yīng)[29]。此外，高倍鏡下光源對(duì)配子的潛在影響尚未可知，也存在一定的安全隱患。因此，Meta分析關(guān)于IMSI的隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果表明目前尚沒(méi)有證據(jù)支持臨床應(yīng)用IMSI[30]。

綜上所述，目前報(bào)道的這些精子優(yōu)選方法在一定程度上能提高精子質(zhì)量，但是這些優(yōu)選方法目前仍然缺乏大量的前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究，缺乏可應(yīng)用于所有ICSI患者的證據(jù)支持。另外，這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、昂貴及潛在的安全隱患阻礙了其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用。因此，建立安全、方便、快捷的精子優(yōu)選方法依然是生殖學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。

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