基于部分酸水解—親水作用—LC—MS的北沙參多糖結(jié)構(gòu)表征

杜寶香+相美容+付業(yè)佩+蔣海強+鞏麗麗+容蓉

[摘要] 由于中藥多糖結(jié)構(gòu)復雜、相對分子質(zhì)量大，難以表征，該研究以中藥北沙參40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides， RGP）為研究對象，應(yīng)用“自下而上”法完成對RGP的結(jié)構(gòu)表征。該文最初采用部分酸水解方法水解RGP，分別考察了酸濃度、水解時間和溫度對其水解效率的影響。在最佳條件（1.5 mol·L-1 TFA， 4 h， 80 ℃）下，RGP被水解為特征性寡糖片段。之后，采用HILIC-LC-MS對RGP部分酸水解產(chǎn)物進行分離和結(jié)構(gòu)表征。同時結(jié)合幾種標準二糖的MS和MS/MS分析，建立依靠質(zhì)譜分析確定多糖糖苷鍵類型的方法。結(jié)果確定了4種糖苷鍵連接類型在MS/MS中的斷裂規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)RGP為含有1， 4-糖苷鍵的線性葡聚糖，水解得到聚合度4～11的葡寡糖。

[關(guān)鍵詞] 部分酸水解； 質(zhì)譜； 親水作用色譜； 北沙參多糖

[Abstract] Water-soluble polysaccharides from traditional Chinese medicine have properties of complex structure and high molecular， resulting in hardly complete their structural characterization.However， a "bottom-up" approach could solve this problem.Glehniae Radix extract was extracted with hot water and then precipitated by 40% ethanol to obtain Glehniae Radix polysaccharides （RGP）. Subsequently， a partial acid hydrolysis method was carried out and the effects of acid concentration， time and temperature on hydrolysis were investigated. Under the optimum hydrolysis condition （1.5 mol·L-1 trifluoroacetic acid， 4 h， and 80 ℃）， RGP were hydrolyzed to characteristic oligosaccharide fragments. Futher， a hydrophilic liquid chromatography- mass spectrometry method was used for the separation and structural characterization of the polysaccharide hydrolysates. According to MS and MS/MS analysis of several standard disaccharides， a method for determining the type of polysaccharide glycosidic linkage by mass spectrometry was established. The results showed that the polysaccharide hydrolysates were linear glucan containing 1， 4-glycosidic bonds. And gluco-oligosaccharides with the degrees of polymerization （DP） of 4-11 were obtained after partial acid hydrolysis.

[Key words] partial acid hydrolysis； mass spectrometry； hydrophilic liquid chromatography； Glehniae Radix polysaccharides

北沙參Glehniae Radix為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidtex Miq的干燥根。味甘、微苦、性微寒，歸肺、胃經(jīng)，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效[1]。研究表明，北沙參主要含有揮發(fā)油類、香豆素類及糖類等成分[2]，作為北沙參的主要成分之一，北沙參總糖量達70%以上[3]，在調(diào)節(jié)機體免疫、消除自由基以及抗癌抗腫瘤等[4-5]方面發(fā)揮著重大作用。

多糖的活性與其單糖組成、相對分子質(zhì)量、糖苷鍵位置及構(gòu)型等因素相關(guān)?？刹捎霉庾V及色譜方法分析中藥多糖的結(jié)構(gòu)特點，進而對其進行表征[6]。獲取結(jié)構(gòu)信息是表征多糖的有效手段，但此過程復雜、繁瑣、需要耗費大量精力。因此，有必要發(fā)展一種簡潔、省時的方法用于中藥多糖的表征。

北沙參40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides，RGP）為混合雜多糖，受蛋白質(zhì)組學“自下而上”法的啟示，對于結(jié)構(gòu)復雜、難以表征的大分子物質(zhì)，可先將其拆分成相對分子質(zhì)量較小的片段，通過對各片段結(jié)構(gòu)的分析，進而完成對該物質(zhì)的表征。本文首先采用部分酸水解方法將RGP降解為特征性寡糖片段，之后，使用親水作用色譜以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法完成對寡糖片段的分離及表征研究，進而獲取RGP的組成、連接方式等結(jié)構(gòu)信息。同時研究了不同類型糖苷鍵在MS/MS分析中的裂解規(guī)律。該法可直觀反映出多糖成分中糖單元的個數(shù)、組成及比例分布等信息。

1 材料

北沙參藥材購于山東省濟南市百味堂中藥飲片有限公司（批號140301，山東萊陽），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學徐凌川教授鑒定為傘形科植物珊瑚菜G.littoralis的干燥根。三氟乙酸（TFA，純度> 99.0%），購于天津市光復精細化工研究所；實驗用水購自廣州屈臣氏有限公司；乙腈、甲酸（色譜純）購自Fisher Scientific（美國Thermo Fisher Scientific公司）。endprint

Agilent 1260 系列高效液相色譜儀（配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、Agilent G4260B蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），美國Agilent公司）；Q Exactive 型質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；UltiMate 3000高相液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 RGP的制備

取北沙參藥材1 000 g，粉碎，加入6倍體積的80%乙醇回流提取2次，每次2 h，抽濾，藥渣自然晾干至無醇味。取藥渣500 g，按照工藝優(yōu)化中的最佳提取工藝[7]：加入25倍量蒸餾水，94.9 ℃條件下浸提2次，每次2 h，過濾，離心，上清液濃縮至600 mL，得北沙參多糖熱水浸提液。加入適量的無水乙醇，用酒精計測量乙醇濃度，控制在40%，于4 ℃冰箱靜置24 h，抽濾得沉淀，分別用少量無水乙醇和丙酮洗滌2～3次，冷凍干燥，得RGP。

2.2 RGP部分酸水解條件的優(yōu)化[8]

稱取10 mg RGP于具塞試管中，分別考察水解時間、溫度及酸濃度對水解程度的影響。

水解時間分別設(shè)為1，2，3，4，5 h（TFA濃度為1.5 mol·L-1，溫度為80 ℃）；水解溫度分別設(shè)為30，40，60，80，100 ℃（TFA濃度為1.5 mol·L-1，時間為4 h）；酸濃度分別設(shè)為0.5，1，1.5，2，2.5 mol·L-1（溫度為80 ℃，時間為4 h），水解液氮氣吹干，用2 mL乙腈-水（50∶50）溶液溶解，過0.22 μm濾膜，供HILIC HPLC-ELSD分析。

2.3 分析條件

2.3.1 HILIC HPLC-ELSD分析條件 色譜柱為Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）。流動相A為水，B為乙腈；洗脫梯度0～20 min，85%～75% B；21～28 min，60% B；流速0.3 mL·min-1；柱溫室溫；進樣量3 μL。ELSD參數(shù)：漂移管溫度70 ℃；霧化器溫度60 ℃；增益10；載氣氮氣；流速1.2 L·min-1。

2.3.2 HILIC LC-MS聯(lián)用條件 色譜柱Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）。流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；洗脫梯度0～ 20 min，80%～60% B，20～25 min，60% B；流速0.2 mL·min-1；負離子模式；毛細管電壓3.2 kV；鞘氣流30 arb；輔助氣流10 arb；質(zhì)譜掃描范圍m/z 150～2 000；毛細管溫度300 ℃；MS/MS裂解電壓為50，60，70 V。

2.4 樣品溶液的測定

取2.2項不同水解條件下的樣品溶液，按照2.3.1項色譜條件分析，用于水解條件的優(yōu)化選擇。

根據(jù)優(yōu)化后的水解條件，制備RGP水解溶液，按照2.3.2項條件進行HILIC LC-MS 分析；取4種二糖（海藻糖、蜜二糖、纖維二糖、蔗糖）適量，加入乙腈-水（50∶50）溶解，配成一定濃度的對照品溶液，按照2.3.2項條件進行HILIC LC-MS分析，用于建立不同糖苷鍵連接類型二糖在質(zhì)譜中的斷裂規(guī)律。

3 結(jié)果與討論

3.1 北沙參多糖部分酸水解方法的建立

使用“熱水浸提、乙醇沉淀”法對北沙參藥材進行處理，得北沙參40%乙醇沉淀多糖RGP。為得到北沙參特征性寡糖片段，對于影響水解過程的水解時間、溫度以及酸濃度進行了深入研究。

水解之后的多糖采用HILIC HPLC-ELSD進行分析。結(jié)果表明，RGP在HILIC色譜柱上得到較好的分離，根據(jù)分子量由小到大順序依次被洗脫出來。不同溫度下RGP的水解情況，前2 min色譜峰為水解出的單糖及一些雜質(zhì)，2～8 min為寡糖成分，26 min左右為未被水解的北沙參多糖，見圖1。30 ℃時，由于溫度較低，水解不夠充分，大多數(shù)以多糖形式存在；80 ℃時，RGP全部水解成單糖及寡糖；當溫度增至100 ℃，多糖水解程度隨之增加，寡糖幾乎全都水解為單糖物質(zhì)。因此，為得到特征性寡糖片段，最佳水解溫度設(shè)為80 ℃。

以各寡糖峰峰面積之和為評價指標，對水解時間及酸濃度進行分析，見圖2，3。隨著水解時間和酸濃度的增加，寡糖含量均先上升后降低。水解開始時，大分子多糖迅速水解為寡糖，寡糖含量急劇升高；隨著水解程度的增加，部分寡糖水解為分子量更小的單糖，其含量開始降低。為得到較高含量的特征性寡糖，分別取4 h，1.5 mol·L-1為最佳水解時間和酸濃度。

3.2 4種標準二糖的HILIC-MS和MS/MS分析

選擇4種結(jié)構(gòu)確定的二糖：海藻糖、蜜二糖、纖維二糖、蔗糖分別代表4種不同糖苷鍵類型。4種二糖的相對分子質(zhì)量均為342，因此它們在MS分析時沒有差異，但對于不同糖苷鍵鏈接的寡糖，在MS/MS分析時，具有不同的斷裂規(guī)律及質(zhì)量丟失不同。4種二糖的MS/MS圖顯示1，1-糖苷鍵的海藻糖在MS/MS中出現(xiàn)m/z 323，221，179，161的碎片質(zhì)譜峰，分別為母離子341丟失18，120，162，180形成的碎片，其中18為H2O的失去，162為糖殘基（C6H10O5）丟失，180（C6H12O6）為丟失162之后再丟失1分子的H2O。其他二糖的MS/MS中除上述外，還有其他質(zhì)量丟失，見表1。

綜合4種二糖在負離子模式下的MS/MS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①糖苷鍵連接位點的不同會導致相對質(zhì)量丟失的不同，見表1；②除從結(jié)構(gòu)上直接斷裂導致的相對質(zhì)量丟失（162，120，90，60，30），同時存在脫水所導致的相對質(zhì)量丟失（18，78，180 ）；③糖殘基能完整斷裂說明其斷裂位置一定為非1C位的糖苷鍵位點，見圖4。endprint

3.3 RGP HILIC LC-MS及MS/MS表征方法的建立

北沙參多糖經(jīng)過部分酸水解后得到大量特征性寡糖片段，采用HILIC LC-MS在負離子模式下對其進行分析，寡糖片段的總離子流圖（TIC）見圖5。對圖5質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析可知，2 min前為雜質(zhì)峰，包括單糖、二糖及提取物中其他雜質(zhì)，寡糖在2～10 min按聚合度由低到高依次出現(xiàn)，色譜峰1～8對應(yīng)寡糖1～8的相對分子質(zhì)量分別為666，828，990，1 152，1 314，1 476，1 638，1 800。結(jié)合相關(guān)文獻[8]分析，色譜峰1～8依次為聚合度（DP）4～11的中性葡寡糖，因此，本文提取得到的RGP主要被水解為聚合度4～11的葡寡糖。

以聚合度為6的寡糖（色譜峰3）為例，其在負離子模式下的MS/MS信息見圖6，對其二級質(zhì)譜規(guī)律進行分析見圖7。以[M-H]-為母離子，丟失葡萄糖殘基（162）形成一系列C型碎片，m/z 179（C1），341（C2），503（C3），665（C4），827（C5）。一系列完整的C型碎片證明寡糖結(jié)構(gòu)為線性[9]。同時，[M-H]-發(fā)生開環(huán)斷裂，丟失120，形成一些列2，4A型碎片，m/z 221（2，4A2），383（2，4A3），545（2，4A4）， 707（2，4A5），869（2，4A6）；或者丟失78，即丟失60的同時丟失一分子水，形成一系列0，2A-H2O（B）型碎片，m/z 263（B2），425（B3），587（B4），749（B5），911（B6）。此外，在各寡糖的二級質(zhì)譜圖內(nèi)均出現(xiàn)了m/z 341，323，281，263，221，179，161的碎片離子質(zhì)譜峰，其斷裂規(guī)律符合1，4-糖苷鍵，故推測RGP可能為含有1，4-糖苷鍵的線性葡寡糖。

4 結(jié)論

本研究借鑒蛋白質(zhì)組學“自下而上”的方法，完成了對RGP的表征，直觀反映了多糖成分中糖單元的結(jié)構(gòu)、種類等信息。同時采用HILIC LC-MS聯(lián)用的方法研究不同糖苷鍵二糖在MS/MS分析時的斷裂規(guī)律。結(jié)果表明，提取得到的RGP水解后得到聚合度4～11的葡寡糖，為含有1，4-糖苷鍵的線性葡寡糖；發(fā)現(xiàn)了不同糖苷鍵二糖在MS/MS分析時的斷裂規(guī)律，建立了依靠質(zhì)譜分析快速明確糖苷鍵類型的方法。

本研究存在許多不足之處：糖類物質(zhì)因為組成和單位結(jié)構(gòu)的特殊性，其同分異構(gòu)體現(xiàn)象非常普遍，單單依靠質(zhì)譜檢測難以對糖類成分進行定性定量研究，難以確定多糖的具體結(jié)構(gòu)。由于部分酸水解方法的局限性，難以確定多糖中是否存在除1，4-糖苷鍵以外的其他類型的糖苷鍵。之后的研究將對北沙參多糖基于不同類型糖苷鍵水解酶作用下酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。

[參考文獻]

[1] 中國藥典. 一部[S]. 2015：111.

[2] 劉偉， 李中燕， 田艷， 等. 北沙參的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 國際學研究雜志， 2013（3）：291.

[3] 周紅英， 呂莎. 微波輔助提取北沙參多糖工藝及抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016（12）：62.

[4] 孫艷菲， 張學順. 北沙參藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學報， 2015（3）：191.

[5] 林俊， 李萍， 陳靠山. 近5年多糖抗腫瘤活性研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2013，38（8）：1116.

[6] 張彬， 林瑞超， 馮芳. 人參多糖的研究概況[J]. 中國藥事， 2004，18（9）：566.

[7] 相美容， 王朋展， 蔣海強， 等. 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提北沙參多的工藝研究[J]. 山東中醫(yī)雜志， 2017（1）：66.

[8] 梁圖， 傅青， 辛華夏， 等. 基于部分酸水解-親水作用色譜-質(zhì)譜的黃芪多糖結(jié)構(gòu)表征[J]. 色譜， 2014（12）：1306.

[9] Wang H， Xin H X， Cai J F， et al. Fingerprint profiling of Astragalus polysaccharides based on partial acid hydrolysis and comprehensive quality evaluation of Astragalus membranaceus combined with reversed-phase liquid chromatography finger print analysis[J]. Chin J Chromatogr， 2016， 34（7）：726.

[責任編輯 丁廣治]endprint