二元聯(lián)合作用藻紅外測試方法
——以重金屬為例

賀棟才，李星廣，郭蔚華,*，林艷，楊鵬飛，劉晨茜

1. 四川省成都市市政工程設(shè)計研究院，成都 610023 2. 重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045

化學(xué)污染物對自然水體的污染已成為全球性的環(huán)境問題[1]。檢測各污染物的環(huán)境濃度水平、評價其毒性和環(huán)境風(fēng)險一直是科學(xué)界和大眾關(guān)注的焦點[2]。在實際水環(huán)境中，往往有多種化學(xué)污染物同時存在，生物體通常暴露于混合的污染物中，它們對機體同時作用產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)(聯(lián)合作用)與任何一種化學(xué)污染物分別單獨作用所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)完全不同[3]，因此，分析化學(xué)污染物之間的聯(lián)合作用是必要的。

微藻是水體中食物鏈的初級生產(chǎn)者，個體小，多為單細胞，對水環(huán)境污染敏感，可作為受試材料分析化學(xué)污染物間的聯(lián)合作用對自然水體的生態(tài)風(fēng)險。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)對化學(xué)污染物的脅迫作用極為敏感[4]，其中滇池銅綠微囊藻生長快[5-6]、飽和密度高，是測試分析化學(xué)污染物急性毒性和聯(lián)合作用的理想受試生物材料。藻類光合作用的電子傳遞鏈被抑制時，藻類天線色素吸收的光能會產(chǎn)生剩余激發(fā)能[7]，剩余激發(fā)能將以紅外輻射方式向藻細胞外擴散。此外，許多化學(xué)污染物可使酶蛋白變性[8]影響藻的光合磷酸化、氧化磷酸化的能量代謝[9]。因此，化學(xué)污染物作用光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈所產(chǎn)生的熱輻射疊加后更易被儀器測試。有研究報道，Cd2+[10-11]，Hg2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+[12]，樂果[13]，莠去津[14]，敵草隆、百草枯、阿特拉津[15]等對藻光合電子傳遞有抑制作用，紅霉素、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑等抗生素[16]，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[17]，硝磺草酮[18]，Ni、Zn、Al[9]等對藻光合磷酸化、氧化磷酸化有影響。藻類暴露于重金屬、農(nóng)藥、有機化學(xué)藥品、抗生素等有毒物質(zhì)時，能產(chǎn)生強于其他微生物的更強的能量變化，可以用紅外測溫儀檢測到藻類的紅外輻射變化[19-22]。

藻紅外測試法和發(fā)光細菌法屬急性毒性微生物測試法，具有靈敏、快速、簡便的特點[23-29]。相比較而言，作為受試生物材料的藻類分布廣泛、藻種豐富、藻源充足，藻種的采取、純化、擴大、培養(yǎng)等容易，藻種獲取成本低，測試用藻有保障，同時，紅外測溫儀價格遠低于發(fā)光細菌法所用的檢測儀，因而藻紅外技術(shù)更能滿足一般科研院所、科研團隊和基層部門對技術(shù)的需求。

建立聯(lián)合作用藻紅外測試技術(shù)極為復(fù)雜，要考慮測試條件、測試藻種、藻溫測試方法、藻響應(yīng)藥品的評價方法、聯(lián)合作用評價方法[30]、聯(lián)合作用偏差f值的修正、藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)處理軟件等技術(shù)環(huán)節(jié)。在聯(lián)合作用測試[31-32]中不斷發(fā)現(xiàn)問題，為保證與控制測試結(jié)果的質(zhì)量，已完善了測試條件，改進了藻溫的測試方法[33]，修正了f值，確立了藥液配制的參照濃度分析方法等。二元聯(lián)合作用測試是多元聯(lián)合作用分析的基礎(chǔ)，所建立的聯(lián)合作用藻紅外測試方法能否測試分析聯(lián)合作用、效果如何等問題仍需要實驗檢驗?；瘜W(xué)污染物的種類繁多，實驗以種類數(shù)相對穩(wěn)定的重金屬作為測試藥品，進行重金屬二元聯(lián)合作用藻紅外測試方法的驗證研究。

本文將通過藥品的參照濃度分析確定測試藥液的配制濃度，進行重金屬二元聯(lián)合作用測試，分析測試結(jié)果的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性，檢驗測試效果，確定二元聯(lián)合作用藻紅外測試方法的可行性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用藻為滇池銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosain Dianchi Lake in China)，藻種及其培養(yǎng)基配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。測試藥品為CuSO4·5H2O、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、AlCl3·6H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4、Cd(NO3)3·H2O、Pb(NO3)2、ZnCl2，為國產(chǎn)分析純，藥液濃度為重金屬濃度(g·L-1)，藥液現(xiàn)測現(xiàn)配。儀器設(shè)備包括ST60便攜式紅外測溫儀(靈敏度0.1 ℃)，購自福祿克測試儀器(上海)公司重慶分公司；HETTICH-EBA離心機，購自球興科儀國際貿(mào)易(上海)有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱(靈敏度±0.2 ℃)，購自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；MOTICBA200數(shù)碼顯微鏡，購自上海中恒儀器有限公司；DR/4000U分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。測試杯為直徑4 cm、高3 cm、厚0.1～0.2 cm的透明絕熱塑料容器。

1.2 數(shù)據(jù)分析軟件

測試藻溫處理與聯(lián)合作用分析可由軟件完成或人工完成。所用軟件有：①AITAS (Algae Infrared Toxican Analysis Software)藻紅外急性毒性分析軟件，用于分析藻對藥品濃度或樣品的響應(yīng)；②AITHCAS (Algae Infrared Time and Half Concentration Analysis Software)藻紅外倍半濃度分析軟件，用于分析同藥倍半關(guān)系濃度；③AICEAS (Algae Infrared Combined Effect Analysis Software)藻紅外聯(lián)合作用分析軟件，用于分析藥品間的聯(lián)合作用類型。上述軟件AITAS、AITHCAS、AICEAS由郭蔚華、祁小明等開發(fā)。

1.2 藻溫測試方法

為了提高藻對藥液響應(yīng)的評價效率，將原來的藻溫測試10遍改為9遍，因此在1.3.3中指標(biāo)③的藻響應(yīng)率由原來的≥60%改為≥55%。

藻溫測試在室內(nèi)條件下進行，采用散射日光或人工光源采光。實驗的藻液用量為5 mL·杯-1，藻密度≥3.16×109個·L-1；測試杯加藻液前，藻液充分搖均；當(dāng)培養(yǎng)時藻增長率≤0時，藻液不再用于實驗；測試一種藥物的聯(lián)合作用時，使用同一批培養(yǎng)的藻液。滴加藥液前，藥液充分搖勻。

當(dāng)測試杯排放好后(圖1、圖2)，每個測試杯中加入5 mL藻液，進行加藥前測溫記錄，每杯每次連測3個藻溫。然后滴加藥液，其中，蒸餾水毒性測試時用滴液管分別滴加蒸餾水1滴(約0.05 mL)于加藥組、對照組的測試杯中，重金屬毒性測試時用滴液管分別滴加藥液、蒸餾水各1滴于加藥組、對照組的測試杯中，立即進行加藥后的測溫記錄，每次每杯連測3個藻溫。測溫時，紅外測溫儀頭部距離藻液正上方10～15 cm，指示紅色光點對準(zhǔn)藻液面中心時測溫。每杯每次連測3個藻溫，用于計算平均值。測溫順序：從上到下，從左到右。測溫遍數(shù)：3個重復(fù)測溫完畢時即為測溫1遍。藥液滴入藻液后到藻產(chǎn)生響應(yīng)有一個過程，藻對不同藥液的響應(yīng)過程不同，加藥前測溫1遍，加藥后測溫9遍。前一遍測溫完成后接著下一遍測溫。

藻溫記錄：按照測試項目的測試杯布局方式、測溫要求制作藻溫記錄表，測溫時將藻溫記錄于表中。

1.3 藻溫處理

1.3.1 藻溫處理方法

T=(Tn1+Tn2+Tn3)/3

(1)

Tni=(Tb1+Tb2+Tb3) /3

(2)

Tbi=(T1+T2+T3) /3

(3)

其中，T為每遍測溫的處理組藻溫；Tn1、Tn2、Tn3分別為3次重復(fù)的平均藻溫；Tni為重復(fù)組的平均藻溫，i=1,2,3；Tb1、Tb2、Tb3分別為空白、對照、加藥的測試杯的平均藻溫；Tbi為每個測試杯的平均藻溫，i=1,2,3；Ti為每個測試杯連續(xù)測試的藻溫(3個藻溫)，i=1,2,3。

1.3.2 藻溫差計算方法

ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣, ΔT>0

(4)

ΔTj=(Tj- ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(5)

ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(6)

上式(4)、(5)、(6)分別為藻響應(yīng)溫差，加藥組藻溫差和對照組藻溫差的計算方法。其中，Tj-ti為加藥后加藥組的藻溫；Tj-t0為加藥前加藥組的藻溫；Tk-ti為加藥后空白組的藻溫；Tk-t0為加藥前空白組的藻溫；Td-ti為加水后對照組的藻溫；Td-t0為加水前對照組的藻溫；j為加藥組，滴加藥液；d為對照組，滴加蒸餾水；k為空白組，不滴加藥液或蒸餾水；ti為測溫遍數(shù)，i=0，為加藥前的測溫；i=1, 2,…,9為加藥后第1, 2,…,9遍測溫。

1.3.3 藻對藥液響應(yīng)的三指標(biāo)評價法

當(dāng)藻溫差同時滿足下面3個指標(biāo)時，即為藻對藥液產(chǎn)生響應(yīng)。

指標(biāo)①—最大藻溫差比較值，即加藥后9遍測溫中，︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。

指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)≥55%，即加藥后9遍測溫中，∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出現(xiàn)次數(shù)≥5。

1.3.4 首測結(jié)果的再現(xiàn)性、最終測試結(jié)果的重現(xiàn)性

首測結(jié)果的再現(xiàn)性用于分析第一次測試結(jié)果的可信性，最終測試結(jié)果的重現(xiàn)性用于分析最終測試結(jié)果的可靠性。

首測結(jié)果的再現(xiàn)性=(與首測結(jié)果相同的結(jié)果數(shù)/實驗數(shù))×100%

再現(xiàn)性的出現(xiàn)率=(具有再現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)/總結(jié)果數(shù))×100%

最終測試結(jié)果的重現(xiàn)性=(相同結(jié)果數(shù)/實驗數(shù))×100%

重現(xiàn)性的出現(xiàn)率=(具有重現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)/總結(jié)果數(shù))×100%

1.3.5 聯(lián)合作用最終測試結(jié)果的確認(rèn)

在3次相同測試中，具有重現(xiàn)性的結(jié)果即為聯(lián)合作用最終測試結(jié)果。

1.4 聯(lián)合作用的評價

1.4.1 聯(lián)合作用指數(shù)偏差法

二元聯(lián)合作用采用聯(lián)合作用指數(shù)偏差法進行評價。聯(lián)合作用指數(shù)(θ)的計算式為

(7)

其中，θ為聯(lián)合作用指數(shù)；△TABmax為A、B藥聯(lián)合時產(chǎn)生的藻最大響應(yīng)溫差；△TA為△TABmax出現(xiàn)的測溫遍數(shù)時，A藥的藻響應(yīng)溫差；△TB為△TABmax出現(xiàn)的測溫遍數(shù)時，B藥的藻響應(yīng)溫差。

1.4.2 評價方法

θ> 1+f

協(xié)同作用(Synergistic effect)

1-f≤θ≤ 1+f

相加作用(Additive effect)

當(dāng)θ<1-f時：

△TABmax

△TABmax>max(△TA, △TB) 獨立作用(Independent effect)

1.4.3 用于聯(lián)合作用指數(shù)θ分析的藻響應(yīng)溫差

θ分析用的聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)溫差：聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)通過三指標(biāo)法，在9遍測溫結(jié)果中最大的藻響應(yīng)溫差(△TABmax)用于θ分析。

游粱式抽油機具有結(jié)構(gòu)簡單和可靠性高等優(yōu)點,使其在采油設(shè)備中有廣泛的應(yīng)用。抽油機都采用較大功率驅(qū)動電機來解決啟動問題,但正常運行時效率低下。抽油機的數(shù)量巨大,因而抽油機的節(jié)能降耗研究具有重要的意義[1]。為此進行了大量的探索,這些探索工作可以分成兩類,對抽油機機械結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和對電機運行特性的改善。當(dāng)抽油機上沖程時電機處于電動狀態(tài);下沖程時,電機處于發(fā)電狀態(tài)會產(chǎn)生“泵升電壓”。這部分能量通常采用外接功率電阻,以能耗制動的方式將這部分能量消耗掉。雖然這種方案結(jié)構(gòu)簡單,容易實現(xiàn),但是功耗電阻的發(fā)熱有可能引發(fā)安全問題并縮短設(shè)備壽命,更重要的是造成了能量的浪費不利于油田的節(jié)能降耗。

θ分析用的單藥藥液的藻響應(yīng)溫差：指標(biāo)①中最大藻響應(yīng)溫差(△TABmax)出現(xiàn)時刻(測溫遍數(shù))的單藥的藻響應(yīng)溫差(△TA、△TB)用于θ分析。單藥的藻響應(yīng)溫差0時，以0計。當(dāng)△TA=0、△TB=0同時出現(xiàn)時，重新測試藻溫。

1.5 聯(lián)合作用測試分析

步驟依次為參照濃度分析、聯(lián)合作用測試、聯(lián)合作用評價和重現(xiàn)性分析。

1.5.1 參照濃度的分析

參照濃度是指聯(lián)合作用測試時藥液濃度的配制標(biāo)準(zhǔn)。分析步驟依次為藻響應(yīng)藥品的濃度梯度分析、敏感濃度分析和參照濃度分析。

(1)藻響應(yīng)藥品濃度梯度的分析

圖1 倍半濃度梯度的測試杯布局Fig. 1 Arrangement of cups in test

藥液濃度梯度設(shè)計為N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32 (單位為g·L-1)，即倍半濃度梯度法。測試杯布局見圖1。

藻溫測試方法見1.2，藻溫現(xiàn)測現(xiàn)記。藻溫分析可用軟件分析，將測試的藻溫輸入AITAS 軟件，分析藻響應(yīng)藥品濃度范圍。藻溫分析也可用人工分析，將測試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析藻響應(yīng)藥品濃度范圍。如果沒有找到藻響應(yīng)藥品濃度范圍，重新設(shè)計藥液濃度梯度再測試。

(2)藻響應(yīng)藥品的敏感濃度分析

藻響應(yīng)藥品的敏感濃度(簡稱敏感濃度)是指藥品濃度增減引起藻響應(yīng)溫差增減的藥品濃度。首先進行同藥倍半關(guān)系濃度的初步分析。同藥倍半關(guān)系濃度是指引起藻響應(yīng)溫差倍半變化的同一種藥的倍半濃度。因同藥一分為二測得的聯(lián)合作用為相加作用，用它來分析藥品的敏感濃度。可以用軟件分析，將測試的藻溫輸入AITHCAS，分析藥品的同藥倍半關(guān)系濃度。也可用人工分析，將測試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進行聯(lián)合作用指數(shù)θ計算(由于只有1個單藥的藻響應(yīng)溫差，計算時單藥的藻響應(yīng)溫差用乘以2來處理)，再根據(jù)聯(lián)合作用評價方法(1.4.2)分析同藥倍半關(guān)系濃度是否為相加作用。分析結(jié)果為相加作用，進行下一步分析。否則，重新測試。

接下來進行同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析。對初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度再進行2次相同測試，如相加作用結(jié)果能夠再現(xiàn)，即通過再現(xiàn)性分析。這時同藥倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)藥品的敏感濃度，可進行聯(lián)合作用測試時藥液配制的參照濃度分析。

圖2 二元聯(lián)合作用的測試杯布局Fig. 2 Arrangement of cups in binary combined effect test

測試杯布局見圖2，藻溫測試方法見1.2。相加作用分析可采用軟件分析，將測試藻溫輸入軟件AICEAS，分析相加作用。也可采用人工分析，將測試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進行聯(lián)合作用指數(shù)θ計算，根據(jù)聯(lián)合作用評價方法(1.4.2)分析相加作用。如果分析結(jié)果為相加作用，即可進行參照濃度分析。

參照濃度確定的原則為在測試的2種藥品中，以毒性大的藥品的同藥倍半關(guān)系濃度的倍濃度、半濃度作為聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。聯(lián)合藥液[A+B]=單藥液[A]+單藥液[B]，其中，單藥液[A]=單藥液[B]。參照濃度確定的方法為比較2種藥品的同藥倍半關(guān)系濃度，找出其濃度小藥品(即毒性大的藥品)，以其倍濃度、半濃度作為測試用的聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。比如，測試同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)時，A為4:2，B為2:1，B小于A，即B毒性大于A，根據(jù)參照濃度確定原則，以B的同藥倍半關(guān)系濃度作為測試藥液配制的參照濃度，聯(lián)合藥液濃度:單藥液的參照濃度為2:1。

1.5.2 聯(lián)合作用測試

(1) 藥液配制

按參照濃度確定的原則和方法配制測試藥液的濃度(1.5.1(1))。

(2) 藻溫測試

測試杯布局見圖2；藻溫測試方法見1.2。

(3) 藻溫分析

軟件分析：將測試藻溫輸入軟件AICEAS，進行聯(lián)合作用類型分析。

人工分析：將測試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進行聯(lián)合作用指數(shù)θ計算。

1.5.3 聯(lián)合作用測試

根據(jù)聯(lián)合作用評價方法(1.4.2)分析聯(lián)合作用類型。

1.5.4 測試結(jié)果的重現(xiàn)性分析

首次聯(lián)合作用測試完成后，再進行2次相同測試，以有重現(xiàn)性的聯(lián)合作用類型作為最終測試結(jié)果。

2 結(jié)果(Results)

2.1 參照濃度分析結(jié)果

2.1.1 藻響應(yīng)的重金屬濃度梯度

由表1可知，藻響應(yīng)的重金屬濃度(g·L-1)梯度中Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)均為8、4、2、1、0.5、0.25；Fe(Ⅲ)為8、4、2、1；Al(Ⅲ)為8、1、0.5、0.25；Cr(Ⅲ)為8、4、2、0.25；Zn(Ⅱ)為8、4、2、0.5、0.25。

2.1.2 初步分析的同藥(重金屬)倍半關(guān)系濃度

由表2可知，初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)為2:1，Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。

2.1.3 同藥倍半關(guān)系濃度的驗證分析

由表3可知，同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果的再現(xiàn)性測試中，8種首測結(jié)果為相加作用的都具有再現(xiàn)性，首測結(jié)果相加作用的出現(xiàn)率為89%，表明首測結(jié)果的可信性高。1種首測結(jié)果為拮抗作用的沒有再現(xiàn)性，但最終結(jié)果為相加作用，且具有重現(xiàn)性。

表1 藻響應(yīng)重金屬的測試結(jié)果Table 1 Test results of algae response to heavy metals

注：藻對藥液有響應(yīng)用“+”表示，藻對藥液無響應(yīng)用“-”表示。測試藻為滇池銅綠微囊藻，藻密度≥3.14×109個·L-1，環(huán)境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： “+”, algae responds to liquid, “-”, algae didn’t respond to liquid; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1；environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表2 同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果Table 2 Preliminary analysis results of concentration relation for the same medicine

注：有相加作用為“+”，無相加作用為“-”。測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環(huán)境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： Additive effect is "+", no additive effect is "-"; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

通過再現(xiàn)性分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)均為2:1；Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。根據(jù)敏感濃度定義，這些重金屬倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)的敏感濃度。

2.1.4 藥液配制的參照濃度

由表4可知：①聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=0.5:0.25(g·L-1)的二元組合是：Cu2++Fe3+、Cu2++Mn2+、Cu2++Hg2+、Cu2++Cd2+、Cu2++Pb2+、Cu2++Zn2+、Fe3++Hg2+、Mn2++Hg2+、Al3++Hg2+、Cr3++Hg2+、Cu2++Al3+、Cu2++Cr3+、Hg2++Cd2+、Hg2++Pb2+、Hg2++Zn2+。②聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=2.0:1.0(g·L-1)的二元組合是： Cr3++Cd2+、Cd2++Zn2+、Pb2++Zn2+、Cr3++Pb2+、Fe3++Cd2+、Fe3++Cr3+、Fe3++Pb2+、Fe3++Zn2+、Cr3++Zn2+、Cd2++Pb2+。③聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=1.0:0.5(g·L-1)的二元組合是：Fe3++Mn2+、Fe3++Al3+、Mn2++Cd2+、Al3++Cr3+、Al3++Cd2+、Al3++Pb2+、Al3++Zn2+、Mn2++Al3+、Mn2++Cr3+、Mn2++Pb2+、Mn2++Zn2+。

2.2 同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性和重現(xiàn)性

由表3可知，在9種重金屬的同藥倍半關(guān)系濃度分析中8種重金屬的首測結(jié)果為相加作用，其中6種首測結(jié)果的再現(xiàn)性為100%，另2種再現(xiàn)性為50%，全部首測結(jié)果再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為89%；9種相加作用結(jié)果中，6種的重現(xiàn)性為100%，3種的重現(xiàn)性為67%；9種相加作用結(jié)果重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%。分析表明，二元聯(lián)合作用藻紅外測試方法的測試效果較好。

表3 同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析結(jié)果Table 3 Reproducibility analysis results of concentration relation for the same medicine

注：測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環(huán)境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表4 重金屬二元聯(lián)合作用藻紅外測試分析結(jié)果Table 4 Analysis results of binary combined effects of heavy metals in algae infrared test

續(xù)表聯(lián)合作用測試藥液Jointactiontestsolution第1次實驗Firstexperiment第2次實驗Secondexperiment第3次實驗Thirdexperiment二元組合Binarycombination參照濃度[兩藥]:[單藥]/(g·L-1)ReferenceconcentrationTwodrugs:Onedrug/(g·L-1)指數(shù)Index(θ)類型Type指數(shù)Index(θ)類型Type指數(shù)Index(θ)類型Type再現(xiàn)率Reappearancerate重現(xiàn)率Recurrencerate結(jié)果Result再現(xiàn)性的出現(xiàn)率Occurrencerateofreappearance重現(xiàn)性的出現(xiàn)率Occurrencerateofrecurrence總再現(xiàn)性出現(xiàn)率Totalrateofreappearance總重現(xiàn)性出現(xiàn)率TotalrateofrecurrenceCr3+,Pb2+2.0:1.00.51獨立Indepedent1.60協(xié)同Synergism1.90協(xié)同Synergism0%67%協(xié)同SynergismCu2+,Al3+0.5:0.251.09相加Additive0.34拮抗Antagonism0.09拮抗Antagonism0%67%拮抗AntagonismCu2+,Cr3+0.5:0.250.56拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism1.54協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Cr3+2.0:1.00.09拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.67協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Pb2+2.0:1.00.39拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.65協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Zn2+2.0:1.00.08拮抗Antagonism0.43拮抗Antagonism0.15拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismMn2+,Al3+1.0:0.50.49拮抗Antagonism0.93相加Additive0.55拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Cr3+1.0:0.50.57拮抗Antagonism0.28拮抗Antagonism1.60協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Pb2+1.0:0.50.35拮抗Antagonism1.06相加Additive0.36拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Zn2+1.0:0.50.50拮抗Antagonism1.42相加Additive0.37拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismCr3+,Zn2+2.0:1.00.42拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism0.35拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismHg2+,Cd2+0.5:0.250.40拮抗Antagonism0.25拮抗Antagonism1.43協(xié)同Synergism50%67%拮抗AntagonismHg2+,Pb2+0.5:0.250.27拮抗Antagonism0.50拮抗Antagonism0.66相加Additive50%67%拮抗AntagonismHg2+,Zn2+0.5:0.250.37拮抗Antagonism0.33拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismCd2+,Pb2+2.0:1.00.49拮抗Antagonism0.30拮抗Antagonism0.90相加Additive50%67%拮抗Antagonism0100%93%100%

注：測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環(huán)境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

2.3 測試結(jié)果的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性

由表5可知，在36組的聯(lián)合作用測試結(jié)果中，出現(xiàn)拮抗、相加、協(xié)同3種聯(lián)合作用類型，測試結(jié)果出現(xiàn)多樣性；14組拮抗作用中單組的再現(xiàn)性為50%～100%、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為93%，單組的重現(xiàn)性為67%～100%、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%，21組相加作用中單組的再現(xiàn)性為50%～100%、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86%，單組的重現(xiàn)性為67%～100%、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%，1組協(xié)同作用的重現(xiàn)性為100%、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%；36組聯(lián)合作用測試結(jié)果的再現(xiàn)性為50%～100%、再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86%，重現(xiàn)性為67%～100%、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100%。分析表明，二元聯(lián)合作用藻紅外測試方法的測試效果良好。

3 討論(Discussion)

3.1 測試結(jié)果的再現(xiàn)性與重現(xiàn)性

在同藥倍半關(guān)系濃度測試中(2.2)，相加作用結(jié)果的再現(xiàn)性、再現(xiàn)性的重現(xiàn)率和重現(xiàn)性、重現(xiàn)性的重現(xiàn)率都比較好。在聯(lián)合作用測試結(jié)果中出現(xiàn)的相加、拮抗、協(xié)同的聯(lián)合作用類型，每一種類型的再現(xiàn)性、再現(xiàn)性的重現(xiàn)率和重現(xiàn)性、重現(xiàn)性的重現(xiàn)率都比較好(2.3)。藻紅外測試技術(shù)有較好的測試效果，并細化了測試條件，改進了藻溫測試方法，提出了三指標(biāo)評價法和參照濃度分析方法，修正了聯(lián)合作用偏差f值的結(jié)果。這樣，改進后的藻溫測試方法、三指標(biāo)評價方法、重現(xiàn)性分析能夠保證藻響應(yīng)溫差和藻響應(yīng)藥品評價結(jié)果的質(zhì)量，參照濃度分析方法、二元聯(lián)合作用評價方法、重現(xiàn)性分析能夠控制聯(lián)合作用分析結(jié)果的質(zhì)量。

3.2 測試結(jié)果的多樣性

在聯(lián)合作用測試結(jié)果中出現(xiàn)了相加、拮抗、協(xié)同3種聯(lián)合作用類型，占4種聯(lián)合作用的75%，表現(xiàn)出一定的多樣性。當(dāng)有多種聯(lián)合作用類型出現(xiàn)時，并且每一種類型具有較好的再現(xiàn)性、重現(xiàn)性，表明聯(lián)合作用評價法的f值=0.42是恰當(dāng)?shù)摹．?dāng)測試結(jié)果沒有多樣性時，表明f值過小或過大。

3.3 參照濃度及其分析方法的意義

聯(lián)合作用分析需要定量測出藥品參照濃度(敏感濃度)引起的藻響應(yīng)溫差。因此，測試聯(lián)合作用最為關(guān)鍵的是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)，而參照濃度就是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)，沒有參照濃度聯(lián)合作用測試便無可控性，也就沒有可信的測試結(jié)果，參照濃度在聯(lián)合作用測試中非常重要，因此它是聯(lián)合作用測試的關(guān)鍵技術(shù)。由于藻響應(yīng)的有毒有害物都存在敏感濃度，那么，用參照濃度分析方法就可找出不同有毒有害物的參照濃度，因此藻紅外測試技術(shù)可用于測試重金屬、農(nóng)藥、有機化學(xué)藥品、抗生素等的二元聯(lián)合作用。

3.4 軟件開發(fā)的必要性

在測試1組二元聯(lián)合作用時，配制藥液的參照濃度測試、聯(lián)合作用測試、重現(xiàn)性分析測試中，測試的藻溫數(shù)據(jù)巨大，而且不同數(shù)據(jù)需要專門分析，因此采用軟件處理即可提高分析速度又可避免人工分析易出現(xiàn)的差錯，因此數(shù)據(jù)處理軟件是二元聯(lián)合作用藻紅外測試技術(shù)的重要組成部分。

綜上分析，二元聯(lián)合作用測試結(jié)果具有較好的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性，這是由于測試條件、藻溫測試方法、藻響應(yīng)溫差評價方法能夠保證藻響應(yīng)溫差的質(zhì)量，參照濃度分析方法、聯(lián)合作用評價方法、重現(xiàn)性分析等能夠控制聯(lián)合作用測試結(jié)果的質(zhì)量。藻紅外技術(shù)測試重金屬二元聯(lián)合作用是可行的。參照濃度作為藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)是可行的，在聯(lián)合作用分析中不可或缺。藻響應(yīng)的有毒有害物都存在敏感濃度，用參照濃度分析方法可分析出藻響應(yīng)有毒有害物的參照濃度，因此，藻紅外測試技術(shù)可用于測試重金屬、農(nóng)藥、有機化學(xué)藥品、抗生素等的二元聯(lián)合作用。聯(lián)合作用藻紅外測試中，用AITAS軟件、AITHCAS軟件、AICEAS軟件將大大提高數(shù)據(jù)處理分析的效率。

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