超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在發(fā)酵乳有機酸分析中的應(yīng)用

米智慧，陳永福，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室奶制品加工農(nóng)業(yè)部重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引言

發(fā)酵乳系指牛乳等動物乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵工藝而制成的一大類乳制品，是營養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞氖称分籟1-3]。因此有機酸組成及含量的測定對評價發(fā)酵乳品質(zhì)具有重要作用。

如今測定有機酸的方法主要有：毛細(xì)管電泳法[4-5]、離子排斥色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜法[11]、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]和超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法等[14-15]。液相質(zhì)譜法相對于其它方法具有分離效果好、分離速度快、檢出限低、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點，并且對于有機酸的種類能明確判別。Huang Y與Xiang G等[16-17]利用該方法對有機酸進(jìn)行定量分析。因此，本研究擬充分利用對極性化合物具有極佳保留特性的亞1.8μm顆粒的色譜柱ACQU ITY?HSS T 3，建立快速、靈敏的LC-M S方法并將其應(yīng)用于發(fā)酵乳樣品的定量分析。

1 實驗

（1）儀器。Waters ACQU ITY UPLC-QTOF MS超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，Waters MassLynx 4.1及QuanLynx工作站，Milli-Q純水儀。

（2）試劑。超純水（Milli-Q超純水機制備），甲酸、甲酸鈉（純度為99%），乙腈（Optima?LC-M S級）。

（3）樣品預(yù)處理。將發(fā)酵乳樣品解凍后，準(zhǔn)確稱取1 g于10 mL的EP管中，加1 mol/L HCL 4 mL，漩渦混勻后，取1.5mL混合液于2 m LEP管中，11 000 g高速離心5 min，取1 mL上清液經(jīng)0.22μm膜過濾于樣品瓶中，待測備用。

（4）LC-M S條件。色譜柱W atersHSST 3（1.8μm，2.1mm×100mm），柱溫30℃，流動相分別為（A）0.1%甲酸/1mmol/L甲酸銨溶液-（B）乙腈溶液，梯度洗脫條件（0～0.5 min，3%～3%B；0.5～3 min，3%～10%B；3～4 min，10%～30%B；4～5 min，30%～30%B；5～5.3 min，30%～3%B，運行時間6 min），流速0.25 mL/min，進(jìn)樣體積5.0μL。質(zhì)譜檢測采用ESI負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度450℃，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量600 L/h，并且以亮氨酸-腦啡肽[M-H=554.2615]作為質(zhì)量校正軸的參比物。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別準(zhǔn)確稱取乙酸，乳酸，琥珀酸0.02 g，用超純水充分溶解，再定容到100 mL，乙酸，乳酸，琥珀酸的質(zhì)量濃度為200μg/mL，此溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再逐級進(jìn)行稀釋，配成質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1，2，5μg/mL的混合標(biāo)樣，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ陨鲜?個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣各進(jìn)樣5.0μL，測得峰面積（Y），繪制峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，各化合物在各自濃度范圍內(nèi)線性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

有機酸帶有羧基（-COOH），具有較強的極性，因此適合極性色譜柱。陳永福等[17]采用ZorbaxC 18SB-Aq色譜柱對發(fā)酵乳中的有機酸進(jìn)行分析，雖具有分離效果，但分析時間較長，且靈敏度低，檢出限高，無法檢測到含量較小的有機酸。此外，劉瑤等[18]采用親水作用色譜-質(zhì)譜（H ILIC-LC-M S）測定參附注射液中的有機酸，但平衡色譜柱時間較長。本研究選用對極性化合物具有最佳保留特性的亞1.8μm顆粒的色譜柱W aters ACQU ITY?HSS T 3色譜柱對發(fā)酵乳中有機酸進(jìn)行分離。

2.1.2 緩沖液及濃度選擇

乙酸，乳酸和琥珀酸等有機酸的pKa值范圍在3.5～4.5左右，為了抑制有機酸的電離，本研究選擇緩沖液pH值為2。液相色譜一般采用磷酸鹽緩沖液作為流動相對樣品進(jìn)行分離，但磷酸是非揮發(fā)酸，對液相及質(zhì)譜都有一定的損害，所以本研究采用了甲酸銨緩沖液。由于有機酸具有較強的極性，利用相似相溶的原理，在流動相中加入了體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸。

本研究分別采用3種不同流動相，以梯度洗脫（梯度洗脫條件如表1）的形式進(jìn)行試驗驗證：A為0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液，B為0.1%甲酸-5mm oL甲酸銨溶液與乙腈溶液，C為0.1%甲酸-1 mm o l/L甲酸銨溶液與乙腈溶液。結(jié)果表明，流動相A使目標(biāo)化合物有雜峰，基線較高，色譜峰有毛刺；B中加了甲酸銨緩沖液后其峰型明顯改善，無雜峰，峰型窄且尖，無毛刺且保留時間穩(wěn)定無漂移，改變緩沖液濃度，流動相B體系與C體系在色譜柱上的保留效果基本一致。但是考慮到高濃度的緩沖鹽體系會對色譜柱及溶劑管理器有一定的損害，且會對質(zhì)譜噴霧造成影響，所以采用0.1%甲酸-1 mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈作為流動相。當(dāng)流動相流速為0.2 mL/min時，流速較低，色譜圖峰形較寬；當(dāng)流速為0.25 mL/min與0.3 mL/min的流速對色譜峰型并無太大影響，考慮到質(zhì)譜噴霧效果，故采用0.25 mL/min作為最優(yōu)流速。

表1 流動相梯度洗脫

圖1 有機酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜

2.2 線性范圍與檢出限

將混合標(biāo)樣進(jìn)行逐級稀釋，按低濃度到高濃度進(jìn)行序列進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積以及響應(yīng)值。以有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，計算回歸方程和線性系數(shù)，同時以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)分別測得各化合物的檢出限和定量限，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，各化合物在其濃度范圍內(nèi)線性較好，定量限范圍為10～200 ng/mL，檢出限范圍為2.5～40 ng/mL。

表2 有機酸的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出與定量限 μg/mL

2.3 精密度與回收率實驗

分別向已知濃度的樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（分別相當(dāng)于發(fā)酵乳原有質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%，100%和120%），每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)3份，每一加標(biāo)溶液進(jìn)行5次平行實驗，按照1（4）中的方法，液質(zhì)條件進(jìn)行UPLC-M S分析，記錄峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表3所示。有機酸加樣回收率范圍93.5%～106.07%，各物質(zhì)的回收率符合標(biāo)準(zhǔn)回收率范圍（100%±20%），RSD均小于7%，說明該實驗的精密度良好。

表3 回收率與精密度實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-M S建立了發(fā)酵乳中乙酸、乳酸與琥珀酸的檢測方法。試驗選用ACQU ITY?HSST3色譜柱，以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液，0.1%甲酸-5mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈溶液，0.1%甲酸-1 mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈溶液3種流動相進(jìn)行分析。結(jié)果表明，0.1%甲酸-1 mm o l/L甲酸銨溶液與乙腈溶液體系的色譜峰尖銳且對稱，保留時間穩(wěn)定，響應(yīng)值高。通過繪制有機酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到了3種有機酸的線性回歸方程以及線性范圍。有機酸加樣回收率范圍93.5%～106.07%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在0.5%～7%之間，說明本試驗方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高、回收率合格，為評定發(fā)酵乳的特性提供可靠依據(jù)。

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