基于Image J軟件的肌原纖維蛋白SDS—PAGE優(yōu)化

朱萌+石柳+汪蘭+熊光權(quán)+吳文錦+李新+丁安子

摘要：采用濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)，運用Image J軟件分析不同蛋白質(zhì)濃度、pH、NaCl濃度對肌原纖維蛋白的分離效果。結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)濃度為1.2 mg/mL、pH為7.5、NaCl濃度為0.5 mol/L時，肌原纖維蛋白中各蛋白質(zhì)及其亞基實現(xiàn)較好分離，均勻分布于整個電泳條帶，且各蛋白條帶光密度值能清晰分辨。Image J軟件能有效地應(yīng)用于SDS-PAGE圖像分析。

關(guān)鍵詞：肌原纖維蛋白；SDS-PAGE；Image J軟件

中圖分類號：TS254.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4839-05

Image J軟件是由National Institutes of Health開發(fā)的基于Java的圖像處理軟件，可計算選定區(qū)域內(nèi)分析對象的一系列幾何特征?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物葉片形態(tài)特征描述[1]、金屬顯微定量分析[2]、針織物孔隙率統(tǒng)計[3]、淀粉表面幾何特征分析[4]等場景。目前，Image J軟件在電泳圖像分析中也有應(yīng)用，可將蛋白條帶數(shù)據(jù)進行量化，轉(zhuǎn)化為光密度值，解決了肉眼觀察的不確定性問題[5]。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）作為一種快速、經(jīng)濟、可重復(fù)的蛋白質(zhì)定性、定量分析及特征鑒定的方法，已廣泛應(yīng)用于各種畜禽肉[6]、水產(chǎn)品[7]、水稻[8]、大豆[9]等農(nóng)產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分析檢測。采用條件適宜的緩沖溶液稀釋提取的樣品蛋白，并制備電泳樣品，利用SDS-PAGE中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠所具有的分子篩效應(yīng)，將不同分子量的蛋白質(zhì)及其亞基進行分離，從而達到分辨蛋白質(zhì)的目的。但對于一些極端條件下的樣品蛋白，如高NaCl濃度的醬油發(fā)酵液、蛋白酶解液等，不能直接運用SDS-PAGE手段進行分析檢測。因此，本試驗對肌原纖維蛋白在不同溶液環(huán)境（蛋白質(zhì)濃度、pH和NaCl濃度）條件下進行SDS-PAGE，采用Image J軟件對電泳圖像進行數(shù)據(jù)量化，綜合光密度值指標，得到適宜的溶液環(huán)境條件范圍，為極端條件下的SDS-PAGE的樣品準備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 500 g左右的新鮮健康草魚（Ctenopharyngodon idellus），購于湖北省武漢市武商量販農(nóng)科城店。30 min內(nèi)低溫運送到實驗室用于提取肌原纖維蛋白。

磷酸、鹽酸、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、甲醛、冰乙酸、氯化鎂、考馬斯亮藍R-250、G-250，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；過硫酸銨、30%丙烯酰胺Acr-Bis、蛋白上樣液、電泳緩沖液、1.5 mol/L Tirs-HCl，武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；Pre-stained Protein Marker，天根生化科技有限公司（11-245 kDa）；EGTA，美國Biosharp公司；Tris-BASE、0.5M Tris-HCl，美國Dow Chemical公司；四甲基乙二胺（TEMED），美國MYM公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F050A片冰機，福建雪人股份有限公司；GL-21M離心機、HI650R離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；722N可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；PB-10 Sartorius pH計，德國Sartorius公司；T18高速均質(zhì)機，德國IKA公司；DYY-12型電泳儀電源、24DN制膠器、電泳槽、WD-9406型膠片觀察燈，北京市六一儀器廠；Universal Hood Ⅱ凝膠拍照系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；SHA-C恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取肌原纖維蛋白 參照Wu等[10]的方法，取新鮮草魚背部肌肉45 g，切碎，加入4倍體積的分離緩沖溶液（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L H3PO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0）高速勻漿30 s后，低溫離心（2 000 g，15 min，4 ℃），重復(fù)操作2次；取沉淀再用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液高速勻漿30 s，低溫離心（2 000 g，15 min，4 ℃），重復(fù)操作1次，得到的沉淀即為肌原纖維蛋白，保存于 4 ℃冰箱，48 h內(nèi)可用。蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍法[11]測定。

1.3.2 制備電泳樣品 不同蛋白質(zhì)濃度：采用Tris-HCl緩沖液（0.5 mol/L NaCl，pH 7.5）對肌原纖維蛋白進行稀釋，獲得終濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。

不同pH：采用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.5 mol/L NaCl）調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白濃度至1.2 mg/mL，然后采用1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的蛋白質(zhì)溶液。

不同NaCl濃度：采用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）對肌原纖維蛋白進行稀釋，獲得終濃度為1.2 mg/mL，NaCl濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的蛋白質(zhì)溶液。

分別取100 μL上述蛋白質(zhì)溶液置于1.5 mL的離心管，加50 μL上樣液，混勻并在沸水中加熱3 min，冷卻至室溫，即為制備的SDS-PAGE樣品。將樣品儲存于-20 ℃冰箱，一周內(nèi)進行試驗。

1.3.3 電泳條件 制膠：參考Laemmli[12]的方法，采用5%的濃縮膠、12%的分離膠進行制膠。

上樣：蛋白樣品上樣量為10 μL，Marker上樣量為5 μL。

電泳：將適量電泳緩沖液加入電泳槽中，直至沒過凝膠。連接電源，設(shè)定起始電壓80 V，電流50 mA；待樣品從濃縮膠進入分離膠后，電壓調(diào)整至120 V；待凝膠中藍色指示線完成消失，電泳結(jié)束。endprint

染色及脫色：將玻璃板上凝膠剝離，在染色液（50%甲醇+10%冰乙酸+0.1%考馬斯亮藍R-250+40%水）中振蕩浸泡2 h，然后轉(zhuǎn)至脫色液（50%甲醇+10%冰乙酸+40%水）中脫色30 min，再用去離子水浸泡凝膠，并每2 h更換1次去離子水，直至凝膠中電泳條帶清晰。

照相：采用Universal Hood Ⅱ凝膠拍照系統(tǒng)進行拍照，光源選擇白光，無濾光片，其余設(shè)置為自動。

1.4 凝膠電泳圖的Image J軟件分析

參考張美碩[13]和陳煒燁等[5]的方法，采用Image J軟件對肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖進行量化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離膠濃度的影響

1.2 mg/mL肌原纖維蛋白溶液（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）在不同分離膠濃度（10%、12%、15%）下的電泳圖如圖1所示。參考Shi等[14]和Araki等[15]的相關(guān)研究，對電泳條帶所屬蛋白質(zhì)亞基進行標注。當分離膠濃度為10%時，標準蛋白（Marker）中分子量為11～25 kDa的蛋白條帶未顯示，樣品中肌球蛋白輕鏈2亞基和3亞基（MLC-2、MLC-3）條帶缺失（圖1a）；與此相反，分離膠濃度為15%時，盡管所有條帶均可見，但樣品中大分子量的肌聯(lián)蛋白（Co）、肌球蛋白重鏈二聚體（MHC-2）、肌球蛋白重鏈（MHC）條帶分布過于緊湊，小分子蛋白條帶模糊（圖1c）。12%的分離膠濃度條件下，肌原纖維蛋白分子量范圍為11～245 kDa的所有條帶清晰可見，且分散均勻（圖1b）。

研究表明，丙烯酰胺聚合物的有效孔徑隨著分離膠濃度的增加而減小[16]。當分離膠濃度為7.5%時，平均孔徑約為50？魡，當分離膠濃度增大至30%時，丙烯酰胺聚合物的平均孔徑則減小到20？魡[17]。本試驗中，當分離膠濃度為10%時，SDS-PAGE凝膠中孔徑較大，在電場作用下肌原纖維蛋白分子量較小的MLC-2（18 kDa）、MLC-3（16 kDa）亞基和部分Marker條帶（11、17、20 kDa）可能因無法被截留而穿透凝膠。當分離膠濃度為15%時，SDS-PAGE凝膠中孔徑較小，雖然實現(xiàn)了MLC-2和MLC-3的分離，但是分子量較大的Co、MHC-2和MHC因遷移率最慢，被截留聚集在凝膠頂部，未得到有效分離。當分離膠濃度為12%時，肌原纖維蛋白中各蛋白質(zhì)及其亞基均實現(xiàn)較好分離，且均勻分布于整個電泳條帶。因此，后續(xù)試驗中選用12%的分離膠濃度。

2.2 肌原纖維蛋白濃度的影響

不同肌原纖維蛋白濃度的SDS-PAGE如圖2所示。隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，MHC、AC等條帶逐漸變寬，顏色也逐漸加深。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為0.3～0.6 mg/mL時，MHC、AC、TM、MLC-1、MLC-3清晰可見，但是TNT、TNI、MLC-2較為模糊，50～100 kDa范圍的蛋白質(zhì)沒有顯現(xiàn)。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為0.9 mg/mL時，50～100 kDa范圍的蛋白質(zhì)條帶仍不明顯。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1.2～1.8 mg/mL時，各蛋白條帶均清晰可見。

采用Image J軟件對SDS-PAGE電泳圖進行分析，各蛋白條帶光密度值見表2。結(jié)果表明，檢測到17組蛋白條帶，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，各蛋白條帶光密度值也逐漸增大。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為0.3～0.9 mg/mL時，只檢測到12組，在50～100 kDa范圍內(nèi)的蛋白條帶與凝膠基色差異不明顯，未被軟件識別。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為1.2～1.8 mg/mL時，肌原纖維蛋白中各蛋白條帶光密度值均能清晰識別。但隨著蛋白質(zhì)濃度的進一步增加，肌原纖維蛋白中主要蛋白如MHC、AC等條帶光密度值變化不明顯。因此，蛋白質(zhì)濃度為1.2～1.8 mg/mL時均能得到較好試驗結(jié)果，但從實際操作角度考慮，最佳蛋白質(zhì)濃度為1.2 mg/mL。

2.3 pH的影響

不同pH條件下的肌原纖維蛋白SDS-PAGE如圖3所示。結(jié)果表明，緩沖溶液pH對肌原纖維蛋白SDS-PAGE影響不明顯。pH在5.0～8.0范圍內(nèi)變化時，肌原纖維蛋白中各蛋白及其亞基條帶分布均勻、清晰可見。

Image J軟件分析結(jié)果見表3。共檢測到17組蛋白條帶，與蛋白質(zhì)濃度的Image J檢測結(jié)果一致。隨著緩沖溶液pH的變化，肌原纖維蛋白中主要蛋白如MHC、AC等條帶光密度值呈先下降后上升趨勢，在pH為6.5和7.0時最小，在pH為7.5時最大。因此，緩沖溶液pH在5.0～8.0范圍內(nèi)均能得到較好試驗結(jié)果，緩沖溶液pH為7.5時最佳。

2.4 NaCl濃度的影響

不同NaCl濃度條件下的肌原纖維蛋白SDS-PAGE如圖4所示。當NaCl濃度為0時，肌原纖維蛋白條帶整體色淺不易見，且有部分蛋白條帶缺失，如TNT。當NaCl濃度為1.0～2.5 mol/L時，隨著NaCl濃度的增加，肌原纖維蛋白中主要蛋白MHC、AC、TM等條帶逐漸變窄，顏色變淺；大分子量的Co、MHC-2等條帶逐漸丟失；小分子量的TM、TNT、TNI、MLC-1、MLC-2、MLC-3條帶變化不大。只有當離子強度為0.5 mol/L時，肌原纖維蛋白中各蛋白質(zhì)及其亞基均清晰可見，效果最優(yōu)。

Image J軟件分析結(jié)果見表4。當NaCl濃度為0時，肌原纖維蛋白中主要蛋白MHC、AC、TM等條帶光密度值遠低于NaCl濃度為0.5 mol/L時。這是因為肌原纖維蛋白為鹽溶蛋白，在NaCl濃度為0時，蛋白質(zhì)溶解度較低，只有少部分蛋白被溶解，使得制備的電泳樣品中蛋白質(zhì)濃度低于1.2 mg/mL。當NaCl濃度由0.5 mol/L增加至1.0 mol/L時，肌原纖維蛋白中肌球蛋白亞基（MHC、MLC-1、MLC-2、MLC-3）、肌鈣蛋白亞基（TNT、TNI）、AC、TM條帶的光密度值均有不同程度增大，表明這些蛋白在NaCl濃度為1.0 mol/L時具有較高的溶解性；大分子量的MHC-2亞基和180 kDa的未知蛋白電泳條帶的光密度值明顯減小，Co條帶消失不見；分子量在35～180 kDa時，蛋白條帶的光密度值維持不變。當NaCl濃度大于1.0 mol/L時，隨NaCl濃度的增加，肌原纖維蛋白質(zhì)所有蛋白及其亞基的光密度值均明顯減小，甚至消失。因此，NaCl濃度為0.5 mol/L時，所有蛋白條帶都能得到最優(yōu)顯示。endprint

3 結(jié)論

肌原纖維蛋白中復(fù)雜的蛋白質(zhì)包含多種蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量在16～480 kDa。分離膠濃度會影響蛋白的遷移率，濃度為12%時肌原纖維蛋白中各蛋白質(zhì)及其亞基實現(xiàn)較好分離。

綜合肉眼觀察和Image J軟件分析，確定了肌原纖維蛋白的SDS-PAGE最佳環(huán)境條件為蛋白質(zhì)濃度1.2 mg/mL、pH 7.5、NaCl濃度0.5 mol/L。對于高NaCl濃度的醬油發(fā)酵液、蛋白酶解液等極端樣品，在制備電泳樣品時需進行脫鹽、稀釋等處理，以降低NaCl濃度。Image J將肌原纖維蛋白中各蛋白及其亞基條帶轉(zhuǎn)化為光密度值，解決了肉眼觀察的不確定性，提高了準確性，能有效地應(yīng)用于SDS-PAGE圖像分析。

參考文獻：

[1] 戴志聰，杜道林，司春燦，等.用掃描儀及Image J軟件精確測量葉片形態(tài)數(shù)量特征的方法[J].廣西植物，2009（3）：342-347.

[2] 朱驥飛，張 立，徐 濤，等.基于Image J軟件的硬質(zhì)合金顯微組織參數(shù)化定量分析[J].粉末冶金材料科學(xué)與工程，2015（1）：26-31.

[3] 馮愛芬，張永久.應(yīng)用Image J軟件進行圖像處理統(tǒng)計織物孔隙率[J].針織工業(yè)，2015（1）：9-11.

[4] 劉 智，王玲玲，周衛(wèi)東，等.用Image J分析水稻胚乳淀粉粒表面幾何特征的方法[J].電子顯微學(xué)報，2011（s1）：466-471.

[5] 陳煒燁，劉冬冬，徐建華，等.Image J軟件在重組質(zhì)粒pET32a-CDK2中蛋白表達的應(yīng)用[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14（1）：23-25.

[6] 董佩諭，孫京新，徐幸蓮，等.SDS-PAGE法檢測動物肌肉蛋白質(zhì)加熱終點溫度的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（11）：65-67，71.

[7] 劉順湖，王瑞韜.五種深海魚提取蛋白的SDS-PAGE分析[J].濟寧學(xué)院學(xué)報，2014，35（3）：43-45.

[8] 李 鵬.應(yīng)用鹽溶蛋白SDS-PAGE技術(shù)鑒定雜交水稻種子純度的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

[9] 王顯生，麻 浩，向世鵬，等.不同SDS-PAGE分離膠濃度條件下大豆貯藏蛋白亞基的分辨效果[J].中國油料作物學(xué)報，2004（2）：76-81.

[10] WU M G，XIONG Y L，CHEN J. Rheology and microstructure of myofibrillar protein-plant lipid composite gels：Effect of emulsion droplet size and membrane type[J].Journal of Food Engineering，2011，106（4）：318-324.

[11] 李 娟，張耀庭，曾 偉，等.應(yīng)用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學(xué)雜志，2000（2）：118-120.

[12] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970， 227（5259）：680-685.

[13] 張美碩.高產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌構(gòu)建、表達與其粗酶微膠囊化研究[D].長春：吉林大學(xué)，2016.

[14] SHI L，BEAMER S K，YIN T，et al. Mass balance for isoelectric solubilization/precipitation of carp，chicken，menhaden，and krill[J].LWT-Food Science and Technology，2017，81：26-34.

[15] ARAKI H，SEKI N. Comparison of reactivity of transglutaminase to various fish actomyosins[J].Nihon-suisan-gakkai-shi， 2008，59（4）：711-716.

[16] HJERTEN S.“Molecular sieve” chromatography on polyacrylamide gels，prepared according to a simplified method[J].Archives of Biochemistry & Biophysics，1962，1（3）：147-151.

[17] ORNSTEIN L. Disc electrophoresis-1. Background and theory in Gel Electrophoresis[J].Annals of the New York Academy of Sciences，1964，121：321-349.endprint