芪參益氣滴丸對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的影響

李良萍+馮越+楊家虎

[摘要] 目的 探討芪參益氣滴丸對糖尿病心肌病大鼠心肌細胞纖維化的影響。 方法 將成功構建糖尿病模型的30只Wistar大鼠隨機分為對照組和治療組，每組各15只。治療組給予芪參益氣滴丸混懸液35 mg/（kg·d）灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃。兩組分別于第3、6、9、12、15周處死大鼠，每組3只。采用TTC染色觀察心肌梗死區(qū)域，采用Masson染色觀察心肌組織膠原情況。 結果 Masson 染色顯示第9、12、15周治療組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較對照組減少。第12、15周治療組大鼠心肌膠原纖維面積百分比低于對照組（P<0.05）。 結論 芪參益氣滴丸具有抑制糖尿病心肌纖維化發(fā)生的作用，可預防糖尿病大鼠心肌纖維化。

[關鍵詞] 芪參益氣滴丸；糖尿病心肌??；大鼠；心肌纖維化

[中圖分類號] R587.2；R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）35-0032-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of Qishenyiqi dropping pills on cardiomyocyte fibrosis in diabetic cardiomyopathy rats. Methods 30 successfully constructed diabetic model Wistar rats were randomly divided into control group（n=15） and treatment group（n=15）. The treatment group was given Qishenyiqi dropping suspension 35 mg/（kg·d） gavage， and the control group was given the same amount of saline gavage. The rats in both groups were sacrificed at the third week， the sixth week， the ninth week， the twelfth week and the fifteenth week， with 3 rats in each group. TTC staining was used to observe the myocardial infarction area. Masson staining was used to observe the myocardial collagen. Results Masson staining showed that the myocardial interstitial collagen fibers in the treatment group were lower than those in the control group in the ninth week， the twelfth week and the fifteenth week. The percentage of myocardial collagen fibers area in the treatment group was lower than that in the control group in the twelfth week and the fifteenth week（P<0.05）. Conclusion Qishenyiqi dropping pills can inhibit the occurrence of diabetic myocardial fibrosis and prevent myocardial fibrosis in diabetic rats.

[Key words] Qishenyiqi dropping pills； Diabetic cardiomyopathy； Rat； Myocardial fibrosis

糖尿病心肌?。―iabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病發(fā)病過程中發(fā)生的特異性心肌損傷，是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。一般認為長期的糖脂代謝紊亂影響糖尿病患者心肌組織的代謝，引起心肌微血管病變，導致大范圍的心肌結構異常，從而發(fā)生左心室肥大、收縮及舒張功能障礙，最終可導致心力衰竭的形成。糖尿病心肌病的主要病理改變?yōu)樾募〖毎蚀蟆⒌蛲龊托呐K間質(zhì)纖維化。這種病理生理改變與高血壓、心肌缺血等損傷因素無明顯關聯(lián)[1]。芪參益氣滴丸是由黃芪、丹參、三七、降香經(jīng)科學配伍，提取有效化學成分精制而成的現(xiàn)代中藥滴丸劑型，方中重用黃芪，取其大補元氣，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷正；氣旺以促津行，行津利尿，則水腫自消。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛的效果。三七具有通絡作用，與丹參共為臣藥。降香氣香辛散，溫通行滯。諸藥合用益氣活血，利水消腫，通絡止痛，得以氣血運行正常，諸證自愈[2]。許多現(xiàn)代藥理研究也從不同的研究方向為芪參益氣滴丸改善心臟功能的作用機制提供了依據(jù)[3-5]。本研究通過建立糖尿病心肌病大鼠模型，探討芪參益氣滴丸對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只Wistar大鼠，雄性，體重200～220 g，8周齡，購于浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2014-0001。所有動物于浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK（浙）2014-0008。

1.2 藥品與試劑

高脂高糖飼料（浙江省實驗動物中心制備），鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma公司，批號：WXBC2044V），羧甲基纖維素鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號2014052901），芪參益氣滴丸（為中藥提純浸膏，主要成分為黃芪261 g、丹參240 g、三七42 g、降香19 g，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)），三諾安穩(wěn)血糖測試儀+三諾安穩(wěn)血糖試條（試條批號：2622NK），0.9%氯化鈉注射液（浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司，批號：130629-2），碘伏（德州欣瑞達消毒制品有限公司，批號：120712）。endprint

1.3 糖尿病大鼠模型構建

40只8周齡Wistar大鼠，適應飼養(yǎng)1周后，給予高脂高糖膳食4周，促發(fā)胰島素抵抗，繼以腹腔注射2次鏈脲佐菌素（STZ）（25 mg/kg+m2），間隔2 d]。觀察大鼠的狀況，于第2次腹腔注射STZ第6天，測量禁食血糖（FBG）、隨機血糖，以2次禁食血糖（FBG）≥11.1 mmol/L或（和）隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠成功造模標準[6]。

1.4 動物給藥

將上述成功構建糖尿病模型的大鼠30只隨機分為治療組和對照組，每組各15只。稱取一定量的芪參益氣滴丸，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配成芪參益氣滴丸混懸液。治療組給予芪參益氣滴丸混懸液灌胃，每日給藥劑量為35mg/kg。對照組予以等量生理鹽水灌胃。兩組分別于灌胃第3、6、9、12、15周處死大鼠，每次兩組各3只。

1.5 觀察指標

1.5.1 TTC染色觀察心肌梗死區(qū)域 分別于灌胃第3、6周后，麻醉快速處死治療組和對照組大鼠，取新鮮的心臟組織，置于-20℃速凍30 min。將冷凍的心臟組織制作成切片，厚3～5 mm，連續(xù)切片；將組織切片置于裝有TTC染色液的器皿中，37℃避光孵育20～30 min，在孵育過程中，需觀察樣本的顏色變化；取出染色后的組織切片，用組織沖洗應用液將組織表面多余的染色液沖洗掉；肉眼觀察并拍照分析。

1.5.2 Masson 染色觀察心肌組織纖維化程度 治療組和對照組大鼠分別于第9、12、15 周灌胃治療后，稱體重，然后麻醉快速處死，取新鮮的心臟通過組織包埋，制作切片。分別進行Masson麗春紅和苯胺藍染色，封片后于顯微鏡下觀察心肌組織纖維化情況。每只大鼠取切片兩張，200倍下隨機選擇視野6處，應用Image J軟件進行圖像分析，計算心肌膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分比。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗及方差齊性分析，采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TTC染色結果

TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感復合物，是呼吸鏈中吡啶核苷結合酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體。TTC 與正常組織中的呼吸酶反應呈紅色，而缺血組織內(nèi)呼吸酶活性下降，不能反應，不產(chǎn)生變化呈白色，即非梗死區(qū)染為紅色，梗死區(qū)染為灰白色，紅色區(qū)與白色區(qū)之間為缺血區(qū)，實驗結果見封三圖2、3。根據(jù)結果圖片，心肌組織經(jīng) TTC 染色后仍為紅色，未發(fā)現(xiàn)灰白色區(qū)，所以第3周、第6周糖尿病心肌病大鼠未見明顯心肌梗死區(qū)域。

2.2 Masson 染色結果

Masson 染色時膠原纖維呈藍色（被苯胺藍所染），肌纖維呈紅色（被麗春紅所染）。對照組大鼠心肌間質(zhì)、血管周圍藍色膠原纖維明顯增多，排列紊亂；治療組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較對照組明顯減少。實驗結果見封三圖4～6。

2.3 對照組與治療組大鼠心肌膠原纖維面積百分比比較

第12、15周治療組大鼠心肌膠原纖維面積百分比較對照組明顯減少。見表1、封三圖7。

3 討論

隨著目前糖尿病的高發(fā)，糖尿病心肌病也呈現(xiàn)上升趨勢。Framingham心臟研究中心的研究顯示：糖尿病患者罹患心力衰竭的可能性是同齡健康對照男性的2倍和女性的5倍[7]。

糖尿病心肌病被定義為糖尿病所致患者的心肌運動功能障礙及心臟結構改變[8]。但目前糖尿病導致心肌損害的發(fā)病機制尚不明確，在糖尿病心肌改變過程中存在細胞氧化損傷、糖脂代謝異常以及心肌細胞外基質(zhì)沉積等病理改變[9，10]，與心肌微血管病變、大范圍心肌結構異常相關，從而發(fā)生左心室肥大、收縮及舒張功能障礙，最終可導致心力衰竭的形成。盡管眾多的臨床和流行病學數(shù)據(jù)均表明糖尿病患者罹患心肌梗死的風險明顯增加，且早期和晚期的死亡率均高于非糖尿病患者，但關于糖尿病動物模型對缺血的敏感性仍然存在爭議。對此，目前的研究多認為與糖尿病的嚴重性、病程、實驗動物的種屬、動物模型（體內(nèi)或體外）及操作過程有關[11，12]。本研究中第3、6周糖尿病心肌病大鼠的心肌組織經(jīng)TTC染色后未見明顯心肌梗死區(qū)域，可能與大鼠的糖尿病病程較短有關，具體原因值得進一步探討。

現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展使得中醫(yī)藥對糖尿病心肌病也有深入的研究。芪參益氣滴丸包含黃芪、丹參、三七以及降香，提取其中有效的化學成分制作而成。許多現(xiàn)代藥理研究從不同的研究方向為芪參益氣滴丸改善心臟功能的作用機制提供依據(jù)。長期高血糖時，由于葡萄糖轉運因子1與4的損耗，葡萄糖由外界進入心肌細胞的速度及數(shù)量均下降，導致心肌細胞供能障礙[13]。同時體內(nèi)過量的糖自身代謝增加，產(chǎn)生大量反應性氧簇（ROS），啟動氧化應激反應，導致糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）過度積累，AGEs可聯(lián)合細胞內(nèi)外膠原組織并導致纖維組織積累[14]。黃芪的主要活性成分之一是黃芪多糖，具有雙向調(diào)節(jié)血糖的作用，對正常小鼠的血糖含量無明顯影響，但卻使葡萄糖負荷后小鼠的血糖水平顯著下降，并能明顯對抗腎上腺素引起的小鼠血糖升高反應和苯乙雙胍致小鼠實驗性低血糖[15]。黃芪多糖可減少糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的過度積累，進而減少細胞內(nèi)外膠原組織的增生。大量的ROS以及一系列異常糖類代謝中間物的積累可導致心肌細胞炎癥及DNA損傷，從而引起異?；虮磉_并啟動一系列細胞凋亡程序[16]。三七總皂苷是三七的主要有效成分，近年研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對多種實驗性炎癥模型具有良好的抗炎活性，可促進抑制性核轉錄因子（NF-κB）的表達從而抑制相關炎癥因子的生成[17]。王大英等[18]研究證實降香可降低 AngⅡ水平，調(diào)節(jié)心肌Bcl-2和Bax蛋白表達，減輕心肌細胞凋亡。心肌細胞壞死所致的炎癥反應可促使心肌成纖維細胞大量分泌膠原組織并沉積于細胞外基質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)重構是糖尿病心肌病的重要發(fā)病機制，包括細胞外基質(zhì)膠原沉積、膠原成分和構型的改變。膠原的沉積、膠原的過量生成與組織型金屬蛋白酶抑制劑的分泌密切相關。丹參的有效成分為水溶性的丹參素和脂溶性的丹參酮，具有提高機體抗凝和纖溶活性、抗凝血和抑制血栓形成、抑制血小板合成和釋放前列腺素類物質(zhì)、抑制血小板聚集、降低全血黏度、改善微循環(huán)障礙、阻斷羥自由基的產(chǎn)生、阻止脂質(zhì)過氧化的作用，是一種有效的氧自由基清除劑[19]。研究顯示，丹參酮ⅡA對糖尿病心肌病的作用是通過TGF-β1/Smad途徑，減輕線粒體超微結構的變化，抑制心肌細胞凋亡，能夠增加左心室射血分數(shù)以及左室收縮末壓，左室舒張壓也顯著增加，顯著改善左心室功能[20]。丹參具有改善心肌微循環(huán)、改善心肌細胞供能、減少心肌細胞炎癥及壞死的作用，從而減少心肌成纖維細胞分泌膠原組織，最終減少心肌纖維化。本研究結果顯示第12、15周對照組大鼠心肌間質(zhì)、血管周圍藍色膠原纖維增多，排列紊亂；而芪參益氣滴丸治療組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較對照組明顯減少，因此本文認為芪參益氣滴丸具有抑制糖尿病心肌纖維化發(fā)生的作用，可預防糖尿病大鼠心肌纖維化。endprint

心肌纖維化是糖尿病心肌病的常見表現(xiàn)，也是最終導致心力衰竭的主要原因。芪參益氣滴丸通過抑制心肌纖維化的程度，延緩心肌病的進程，從而起到改善心肌病的作用，對糖尿病心肌病具有一定的治療作用。目前對糖尿病心肌病的病理過程尚未完全闡明，多種損傷機制仍有待完善，而且較單一的化學藥物而言，芪參益氣滴丸的有效成分多種多樣，其對糖尿病心肌病的具體作用和機制值得更進一步的探討，以期為糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Voulgari C，Papadogiannis D，Tentolouris N. Diabetic cardiomyopathy：From the pathophysiology of the cardiac myocytes to current diagnosis and management strategies[J].Vascular Health & Risk Management，2010，6（6）：883-903.

[2] 龍文，羅建華，周桂花. 芪參益氣滴丸治療慢性心功能不全療效分析[J]. 井岡山醫(yī)專學報，2006，13（1）：47.

[3] 張新友. 芪參益氣滴丸治療糖尿病心臟病合并心功能不全的臨床療效觀察[J]. 中國傷殘醫(yī)學，2016，24（2）：99-100.

[4] 冉永玲，戴小華. 芪參益氣滴丸治療糖尿病心肌病心功能不全臨床療效觀察[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2016，（6）：811-815.

[5] 耿志輝. 三七總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護研究[J]. 吉林醫(yī)學，2007，28（11）：1261-1262.

[6] 林心君，王麒又，辛金鐘，等. 高成模率和高穩(wěn)定性的糖尿病大鼠模型制備——高脂高糖膳食+STZ體重聯(lián)合體表面積法構建糖尿病大鼠模型[J]. 中國老年學雜志，2013，33（9）：2051-2054.

[7] Kannel WB，Mcgee DL. Diabetes and Cardiovascular Disease：The Framingham Study[J]. Jama，1979，241（19）：2035-2038.

[8] Amaral N，Okonko DO. Metabolic abnormalities of the heart in type Ⅱ diabetes[J]. Diabetes & Vascular Disease Research，2015，12（4）：239.

[9] Frustaci A，Kajstura J，Chimenti C，et al. Myocardial Cell Death in Human Diabetes[J]. Circulation Research，2000， 87（12）：1123-1132.

[10] Cai L，Li W，Wang G，et al. Hyperglycemia-Induced Apoptosis in Mouse Myocardium Mitochondrial Cytochrome c-Mediated Caspase-3 Activation Pathway[J]. Diabetes，2002，51（6）：1938-1948.

[11] Liu Y，Thornton JD，Cohen MV，et al.Streptozotoein-induced non-insulin dependent diabetes protects the heart from infarction[J].Circulation，1993，88（3）：1273-1278.

[12] Ravingerova T，Neckar J，Kol？觃r F.Ischemie tolerance of rat hearts in acute and chronic phases of experimental diabetes[J].Mol Cell Biochem，2003，249（1-2）：167-174.

[13] Eckel J，Reinauer H. Insulin action on glucose transport in isolated cardiac myocytes：Signalling pathways and diabetes-induced alterations[J]. Biochemical Society Transactions， 1990，18（6）：1125-1127.

[14] Pappachan JM，Varughese GI，Sriraman R，et al. Diabetic cardiomyopathy：Pathophysiology，diagnostice valuation and management[J]. World J Diabetes，2013，4（5）：177-189.

[15] 李先榮. 注射用黃芪多糖藥理作用的研究：3.對血糖及其肝糖原含量的影響[J]. 中成藥，1989，11（9）：32.

[16] Fang ZY，Prins JB，Marwick TH. Diabetic cardiomyopathy：Evidence，mechanisms，and therapeutic implications[J].Endocrine Reviews，2004，25（4）：543-567.

[17] 胡志潔，張志耘. 三七總皂苷對心腦血管的藥理作用研究[J]. 天津藥學，2006，18（6）：51-55.

[18] 王大英，李勇，范維琥，等. 降香和紅景天對心肌梗死大鼠膠原比值的影響[J]. 中成藥，2007，29（12）：1834-1835.

[19] 孫建波，梁軍，閆玉仙，等. 復方丹參滴丸的臨床應用及作用機理[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2002，11（11）：1087-1088.

[20] Shen N，Li X，Zhou T，et al. Shensong Yangxin Capsule prevents diabetic myocardial fibrosis by inhibiting TGF-β1/Smad signaling[J]. Journal of Ethnopharmacology，2014， 157：161.

（收稿日期：2017-09-13）endprint