油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌的抑菌活性

王夢(mèng)姣

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

稻瘟病是一種真菌性水稻(Oryzasativa)病害[1]，我國(guó)南、北方稻區(qū)均有可能發(fā)生，一般造成減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到40%～50%，有的地方甚至顆粒無(wú)收[2-4]。病原菌為稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)，其還能感染其他重要農(nóng)作物，比如感染大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum)后導(dǎo)致其嚴(yán)重減產(chǎn)[5]。其傳播途徑具有循環(huán)性，并且病原真菌具有不易完全殺滅的特性，因此，水稻等作物的整個(gè)生育期都存在被感染的可能性[5]。目前主要依賴的防治措施，如種植抗性品種、減少菌源、藥劑防治等[6]，均存在一定局限性和不足。尤其是施用的藥劑復(fù)雜，成分多源自化學(xué)合成，一般要進(jìn)行多次藥劑處理，且藥劑作用效果不顯著，極易造成稻田的二次污染[7-8]。因此，研究如何有效抑制稻瘟病菌的傳播、降低其對(duì)農(nóng)作物尤其是對(duì)水稻的侵害至關(guān)重要。

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid,BR)為植物重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一，是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的甾醇類激素[9-12]。研究表明，油菜素內(nèi)酯不僅能夠參與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，還能夠增強(qiáng)植物抵抗病蟲害的能力[13]。Kutschera等[14]認(rèn)為，油菜素內(nèi)酯作為激活劑，能夠激活植物內(nèi)源殺菌劑，進(jìn)而幫助植物抵抗外界病原微生物。但他并沒(méi)有說(shuō)明，油菜素內(nèi)酯激活的是哪種植物內(nèi)源殺菌劑，該殺菌劑如何在植物體內(nèi)起作用。Belkhadir等[15]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯通過(guò)微生物介導(dǎo)的分子模式調(diào)節(jié)植物免疫應(yīng)答的方法，增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的抵抗能力。通過(guò)外源油菜素內(nèi)酯處理，Nakashita等[16]發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯通過(guò)誘導(dǎo)抗性基因這一途徑，達(dá)到提高植物抵抗病蟲害能力的目的。在采用遺傳學(xué)方法改變了黃瓜體內(nèi)的油菜素內(nèi)酯含量后，Xia等[17]發(fā)現(xiàn)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性的增強(qiáng)會(huì)使黃瓜體內(nèi)過(guò)氧化氫含量升高，進(jìn)而幫助油菜素內(nèi)酯提高植株對(duì)病蟲害的抵抗能力。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌抑制作用的研究尚處空白階段，為此，采用油菜素內(nèi)酯及與其具有類似或相反功能的其他4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理稻梨孢菌，探索其對(duì)稻梨孢菌的抑制作用，以期為采用植物源性藥劑防治稻瘟病提供科學(xué)依據(jù)及研究思路。

1 材料和方法

1.1 稻梨孢菌、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的來(lái)源

稻梨孢菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，編號(hào)分別為37631、37661。

選用油菜素內(nèi)酯及其他4種與油菜素內(nèi)酯功能相似或相反的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻梨孢菌進(jìn)行處理，各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相關(guān)信息見表1。

表1 5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相關(guān)信息

1.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定

將固體CPDA培養(yǎng)基(配方為：每1 L培養(yǎng)基中加200 g土豆、5 g蛋白胨、20 g葡萄糖、3.0 g MgSO4、5.0 g KH2PO4、維生素B1和B2各1片、瓊脂8～15 g)高溫高壓滅菌，待溫度降至55 ℃后，加入不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(表2)，混勻、倒平板。待平板表面完全干透后，將培養(yǎng)好的稻梨孢菌從原始平板上切下0.5 cm×0.5 cm方形菌絲塊，接種至新的培養(yǎng)基中部。每種菌每個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度處理做5個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)，每日測(cè)量菌體直徑。待處理濃度為0 μmol/L(對(duì)照)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑平板上菌落長(zhǎng)至滿皿時(shí)，計(jì)算菌絲延伸抑制率[18]，并對(duì)各處理菌落形態(tài)進(jìn)行觀察、拍照。菌絲延伸抑制率計(jì)算公式為：菌絲延伸抑制率=(對(duì)照菌絲延伸長(zhǎng)度-處理菌絲延伸長(zhǎng)度)/對(duì)照菌絲延伸長(zhǎng)度×100%。

采用回歸分析法對(duì)5 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑各處理濃度的對(duì)數(shù)值(x) 和菌絲延伸抑制率的概率值(y) 進(jìn)行分析，計(jì)算出5 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)2種供試菌株的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。

表2 5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理濃度

1.3 油菜素內(nèi)酯對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響試驗(yàn)

將液體CPDA培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，高溫高壓滅菌，待溫度降至55 ℃后，加入0(對(duì)照)、0.5、2 μmol/L epi-BL，混勻，接種0.5 cm×0.5 cm方形菌絲塊，200 r/min、28 ℃搖菌培養(yǎng)。培養(yǎng)第4天(經(jīng)過(guò)前期試驗(yàn)，第4天時(shí)epi-BL對(duì)菌絲延伸抑制現(xiàn)象開始出現(xiàn)；同時(shí)，到第4天時(shí)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好，烘干稱質(zhì)量時(shí)可以忽略初始接種菌塊對(duì)其質(zhì)量的影響)開始，每天取出三角瓶，將菌絲抽濾、洗滌、離心、烘干，稱恒質(zhì)量。至菌絲長(zhǎng)滿三角瓶(第8天)時(shí)停止試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)3次。菌絲干質(zhì)量變化率計(jì)算公式為：M=(Mc-M^)/Mc×100%。M:菌絲干質(zhì)量變化率；Mc:對(duì)照菌絲干質(zhì)量；M^:試驗(yàn)組菌絲干質(zhì)量。

1.4 油菜素內(nèi)酯對(duì)孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)

將0.5 cm×0.5 cm方形菌絲塊分多點(diǎn)接種到米糠培養(yǎng)基(配方為：選無(wú)霉稻草切成3 cm小段，用清水浸泡12 h，充分吸水后倒掉水，加米糠和水，水量以手握時(shí)指間有水珠為宜；干稻草最終比例為75%，米糠為25%)上，置于恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)中培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)滿，將少許無(wú)菌水倒入培養(yǎng)皿中，用毛筆刷下菌絲后，置于365 nm 黑光燈下培養(yǎng)，48 h后，培養(yǎng)皿中即產(chǎn)生大量孢子。刷洗霉層，過(guò)濾、鏡檢，調(diào)配成孢子懸浮液，向其中加入不同濃度的epi-BL(表2)，每個(gè)濃度處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將孢子懸浮液振蕩培養(yǎng)24 h 后，鏡檢孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率，孢子萌發(fā)抑制率= (對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率) /對(duì)照萌發(fā)率×100%[19]。利用回歸分析方法，計(jì)算回歸方程、r和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻梨孢菌菌絲體延伸的抑制作用

由表3可知，epi-BL對(duì)稻梨孢菌菌絲延伸有較強(qiáng)的抑制作用，隨著處理濃度的升高，稻梨孢菌菌落直徑遞減、抑制率升高，抑制率與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度呈正相關(guān)。當(dāng)epi-BL濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)，其對(duì)37631和37661兩種供試菌株菌絲延伸的抑制率均達(dá)到50%以上(分別為58.18%和53.37%)。圖1中A和B分別是37631和37661兩種供試菌在不同濃度epi-BL處理后平皿上的菌落形態(tài)圖。從圖1可以直觀地觀察到，epi-BL對(duì)稻梨孢菌菌絲延伸有較強(qiáng)的抑制作用。同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照平皿相比，在不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理情況下，菌落顏色、表面質(zhì)地、邊緣形狀均發(fā)生改變。37631內(nèi)部菌落顏色隨epi-BL濃度升高而逐漸加深，菌落邊緣有明顯白圈，菌落半徑逐漸縮小，至5 μmol/L處理時(shí)菌絲幾乎不延伸，只能觀察到菌落邊緣白圈；37661菌落顏色隨epi-BL濃度升高也逐漸加深，菌落半徑逐漸縮小，至5 μmol/L處理時(shí)菌落表面質(zhì)地已變?yōu)樗疇?。這說(shuō)明，epi-BL除了能夠強(qiáng)烈抑制菌絲延伸，還能改變菌落形態(tài)。

表3 5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻梨孢菌菌絲延伸的抑制率 %

圖1 不同濃度油菜素內(nèi)酯處理下稻梨孢菌株37631(A)和37661(B)的菌落生長(zhǎng)情況

從表3還可以看出，不同濃度的IAA和ABA對(duì)37631的菌絲延伸具有抑制作用，但抑制作用較小，抑制率均在5%以下；6-BA和GA對(duì)37631的菌絲延伸具有促進(jìn)作用，菌絲抑制率為負(fù)數(shù)。IAA和GA對(duì)37661菌絲延伸具有抑制作用，但抑制作用不明顯；6-BA對(duì)37661具有一定促進(jìn)作用，100 μmol/L ABA對(duì)37661的菌絲延伸具有一定抑制作用，抑制率為19.70%。

對(duì)以上5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理結(jié)果進(jìn)行直線回歸分析，結(jié)果見表4。由表4可以看出， epi-BL、IAA和ABA處理濃度與菌絲延伸抑制率呈正相關(guān)，GA和6-BA呈負(fù)相關(guān)。在正相關(guān)的3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，epi-BL對(duì)37631和37661兩株供試菌的EC50值較小，其毒力回歸方程分別為y=4.432+0.993x和y=3.868+1.576x，EC50值分別為3.7 μmol/L和5.2 μmol/L。

表4 5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻梨孢菌菌絲延伸的毒力回歸分析

2.2 油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌菌絲體生長(zhǎng)量的影響

通過(guò)圖2可以看出，油菜素內(nèi)酯能夠影響稻梨孢菌菌絲體的正常生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增大，epi-BL對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響程度逐漸增大。培養(yǎng)至第8天時(shí)，與對(duì)照組相比，在0.5 μmol/L處理情況下，稻梨孢37631和37661菌絲干質(zhì)量分別減少了29.86%和27.18%；在2 μmol/L處理情況下，稻梨孢37631和37661菌絲干質(zhì)量分別減少了52.60%和48.44%。

圖2 不同濃度油菜素內(nèi)酯處理下稻梨孢菌菌絲體干質(zhì)量的變化

2.3 油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

從表5 可以看出，epi-BL對(duì)稻梨孢菌孢子萌發(fā)具有抑制作用，隨著濃度升高，抑制率逐漸上升。當(dāng)epi-BL濃度為2 μmol/L時(shí)，其對(duì)37631和37661兩個(gè)供試菌株的孢子萌發(fā)抑制率分別為36.89%和23.98%；當(dāng)濃度為5 μmol/L 時(shí)，抑制率分別達(dá)到53.25%和49.34%。這與epi-BL對(duì)稻梨孢菌菌絲延伸抑制的分析結(jié)果一致。

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)，epi-BL的濃度對(duì)數(shù)與孢子萌發(fā)抑制率概率值均呈線性關(guān)系(表6)。epi-BL對(duì)37631和37661兩株菌的毒力回歸方程分別為y=4.446+0.873x和y=4.135+1.071x，EC50值分別為4.31 μmol/L和6.42 μmol/L。

表5 油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌孢子萌發(fā)的抑制率 %

表6 油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌孢子萌發(fā)的毒力回歸分析

3 結(jié)論與討論

某些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑會(huì)直接參與植物抵御外界病原微生物侵染的過(guò)程[20-21]，本試驗(yàn)以2株稻瘟病菌為供試菌株，探究了5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，油菜素內(nèi)酯對(duì)稻瘟病菌菌絲延伸具有明顯的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)，其對(duì)37631和37661兩個(gè)菌株的菌絲延伸抑制率分別為58.18%和53.37%，EC50值分別為3.7 μmol/L和5.2 μmol/L。其他4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)稻瘟病菌菌絲延伸沒(méi)有明顯的抑制作用。菌絲干質(zhì)量測(cè)定結(jié)果顯示，油菜素內(nèi)酯能明顯抑制稻瘟病菌的生長(zhǎng)，在2 μmol/L epi-BL處理情況下，培養(yǎng)至第8天時(shí)37631和37661兩株稻瘟病菌菌絲干質(zhì)量與對(duì)照相比分別減少了52.60%和48.44%。此外，油菜素內(nèi)酯對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)也具有明顯的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)，其對(duì)37631和37661兩個(gè)菌株的孢子萌發(fā)抑制率分別為53.25%和49.34%，EC50值分別為4.31 μmol/L和6.42 μmol/L。

雖然部分植物激素在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育這一功能上具有一定共性，但其在參與植物抵抗病原微生物方面則具有較大差異。例如，油菜素內(nèi)酯和生長(zhǎng)素均具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，但在細(xì)條病菌和稻梨孢菌侵染水稻過(guò)程中，生長(zhǎng)素起毒力因子的作用[22]，然而，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，油菜素內(nèi)酯能夠直接抑制稻梨孢菌生長(zhǎng)。赤霉素和油菜素內(nèi)酯都可以促進(jìn)植物葉和芽的生長(zhǎng)，但李雙勝[23]的研究表明，赤霉素在提高植物抵抗核盤菌的過(guò)程中起正作用因子的作用，但油菜素內(nèi)酯為負(fù)作用因子。本試驗(yàn)結(jié)果表明，油菜素內(nèi)酯對(duì)稻梨孢菌具有顯著的抑制作用，為后續(xù)利用油菜素內(nèi)酯協(xié)助水稻抵抗稻瘟病菌提供了可靠的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

同時(shí)，值得注意的是，稻梨孢不僅菌絲延伸速度受到了油菜素內(nèi)酯的強(qiáng)烈影響，其菌落形態(tài)也產(chǎn)生了一定改變， 37661菌株在5 μmol/L epi-BL處理?xiàng)l件下，菌落形態(tài)改變最為明顯。這說(shuō)明，油菜素內(nèi)酯不僅參與了稻梨孢菌絲體的分裂，還可能涉及其生理生化代謝。其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑雖然沒(méi)有明顯影響稻梨孢菌絲體的延伸速度，但是處理后2個(gè)菌株的菌落表面形態(tài)與對(duì)照相比都發(fā)生了一定變化(未列出)，這說(shuō)明，其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可能也參與了菌體的生長(zhǎng)代謝。

[1] Law J W,Ser H L,Khan T M,etal.The potential ofStreptomycesas biocontrol agents against the rice blast fungus,Magnaportheoryzae(Pyriculariaoryzae)[J].Front Microbiol,2017,8(3):45-66.

[2] Zhong X H,Yang J X,Shi Y L,etal.The DnaJ protein OsDjA6 negatively regulates rice innate immunity to the blast fungusMagnaportheoryzae[J].Mol Plant Pathol,2017,2:12546-12561.

[3] Liu H,Dong S,Gu F,etal.NBS-LRR protein Pik-H4 interacts with OsBIHD1 to balance rice blast resistance and growth by coordinating ethylene-brassinosteroid pathway[J].Front Plant Sci,2017,8:127-135.

[4] Schauer S,Kutschera U.A novel growth-promoting microbe,Methylobacteriumfunariaesp.nov.,isolated from the leaf surface of a common moss[J].Plant Signaling and Behavior,2011,6:510-515.

[5] Liao J H,Chen P Y,Yang Y L,etal.Clarification of the antagonistic effect of the lipopeptides produced byBacillusamyloliquefaciensBPD1 againstPyriculariaoryzaevia in situ MALDI-TOF IMS analysis[J].Molecules,2016,21(12):1670-1692.

[6] 溫小紅,謝明杰,姜健,等.水稻稻瘟病防治方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(3):190-195.

[7] Wang X,Chen Y F,Yan W,etal.Synthesis and biological evaluation of benzimidazole phenylhydrazone derivatives as antifungal agents against phytopathogenic fungi[J].Molecules,2016,21(11):1574-1589.

[8] Wang X,Dai Z C,Chen Y F,etal.Synthesis of 1,2,3-triazole hydrazide derivatives exhibiting anti-phytopathogenic activity[J].Eur J Med Chem,2017,126:171-182.

[9] 王夢(mèng)姣，鄧百萬(wàn)，楊國(guó)鵬.擬南芥油菜素內(nèi)酯的合成、修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(2):1-6.

[10] Khripach V,Zhabinskii V,de Groot A.Twenty years of brassinosteroids:Steroidal plant hormones warrant better crops for the ⅩⅪ century[J].Annals of Botany,2000,86:441-447.

[11] Wang M J,Liu X Y,Wang R,etal.Overexpression of a putativeArabidopsisBAHD acyltransferase causes dwarfism that can be rescued by brassinosteroid[J].Journal of Experimental Botany,2012,63(16):5787-5801.

[12] Greco M,Chiappetta A,Bruno L,etal.InPosidoniaoceanicacadmium induces changes in DNA methylation and chromatin patterning[J].J Exp Bot,2012,63(2):695-709.

[13] Deb A,Grewal R K,Kundu S.Regulatory cross-talks and cascades in rice hormone biosynthesis pathways contribute to stress signaling[J].Front Plant Sci,2016,7:1303-1312.

[14] Kutschera U,Wang Z Y.Brassinosteroid action in flowering plants:A Darwinian perspective[J].Journal of Experimental Botany,2012,63(10):3511-3522.

[15] Belkhadir Y,Jaillais Y,Epple P,etal.Brassinosteroids modulate the efficiency of plant immune responses to microbe-associated molecular patterns[J].PNAS,2012,109(1):297-302.

[16] Nakashita H,Yasuda M,Nitta T,etal.Brassinosteroid functions in a broad range of disease resistance in tobacco and rice[J].The Plant Journal,2003,33:887-898.

[17] Xia X J,Wang Y J,Zhou Y H,etal.Elevated H2O2levels resulting from enhanced NADPH oxidase activity are involved in the BR-induced stress tolerance in cucumber[J].Plant Physiology,2009,150:801-814.

[18] 檀根甲,祝建平.殺菌劑生物測(cè)定計(jì)算方法及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，1998,4(1)：27-28.

[19] 張翠榮,李明,李榮玉.5種植物粗提物對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(8):162-164.

[20] 張智慧,聶燕芳,何磊,等.外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)水稻抗瘟性相關(guān)防御酶和內(nèi)源水楊酸的變化[J].植物病理學(xué)報(bào),2010,40(4):395-403.

[21] 向妙蓮,付永琦,何永明,等.茉莉酸甲酯浸種對(duì)水稻幼苗白葉枯病抗性及抗氧化酶活性的影響[J].中國(guó)水稻科學(xué),2014,28(4):419-426.

[22] 傅晶.抑制病原菌誘導(dǎo)的生長(zhǎng)素的積累賦予水稻廣譜抗性[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[23] 李雙勝.草酸在核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)與寄主植物互作中的生物學(xué)作用[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.