尼康全自動倒置顯微鏡圖像工作站-TiE的配置及其視野矯正

張妍樂 袁粒星 馬志貴 顧玲 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實驗室 （四川 成都 610000）

活細(xì)胞工作站（Live cell Imaging System，LIS）又稱活細(xì)胞顯微成像采集系統(tǒng)，是指在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下，體外觀測活細(xì)胞增殖、遷移、粘附、凋亡等多種活動的監(jiān)測系統(tǒng)[1]。能自分子水平上，做到基因定位定量表達(dá)動態(tài)分析、蛋白質(zhì)合成降解運(yùn)輸動態(tài)研究、蛋白質(zhì)相互作用動態(tài)研究以及代謝動力學(xué)測定等[2]。因此，熟悉活細(xì)胞工作站的具體配置及其使用方法對臨床工作具有重要意義。本研究選取尼康全自動倒置顯微鏡圖像工作站-TiE，介紹其配置及視野矯正方法，現(xiàn)具體報告如下。

1.配置

1.1 顯微鏡目鏡

該顯微鏡包含CFI 10x目鏡鏡頭，TI-TD雙目鏡筒D、TI-TS雙目鏡筒S、TI-TERG人機(jī)學(xué)鏡筒等3種目鏡筒。照明柱使用TI-DS透射照明柱30W或TI-DH透射照明柱100W，聚光鏡包括ELWD聚光鏡、LWD聚光鏡、HMC聚光鏡、ELWD-S聚光鏡、高NA干&油聚光鏡、暗視野聚光鏡、CLWD聚光鏡等7種，實際操作中可根據(jù)實際需要選擇。目鏡筒底座包括TI-T-BPH目鏡筒底座F/PH w側(cè)面照相端口、TI-T-BS目鏡筒底座w側(cè)端口。

1.2 顯微鏡物鏡

顯微鏡物鏡包含CFI 4x，10x，20x，40x，60x物鏡，使用TI-ND6-E電動六孔DIC物鏡轉(zhuǎn)換器、TI-N6六孔物鏡轉(zhuǎn)換器、TI-ND6六孔DIC物鏡轉(zhuǎn)換器、TI-ND6-PFSw/電動六孔DIC物鏡轉(zhuǎn)換器。載物臺為帶編碼器的TI-S-ER電動載物臺，能同時加載TI-S-E電動載物臺（行程：X110x Y75mm，尺寸W400x D300mm）、TI-SR機(jī)械載物臺（行程：X70x Y50mm，尺寸：W310x D300mm）、和TI-SP水平載物臺（尺寸：W260x D300mm）。另外，TI-SP還可與TI-SAM附屬載物臺配合使用。

1.3 顯微鏡調(diào)焦

尼康全自動倒置顯微鏡圖像工作站-TiE選用步進(jìn)馬達(dá)調(diào)節(jié)電動物鏡轉(zhuǎn)換器上/下運(yùn)動，調(diào)整顯微鏡焦距。物鏡調(diào)節(jié)行程為-2.5mm～7.5mm，單次最小步進(jìn)0.025μm，最大速度2.5mm/s。且調(diào)焦過程中，操作人員可自主控制速度，在粗調(diào)、中速、微調(diào)中根據(jù)實際選取。

1.4 操作系統(tǒng)

尼康全自動倒置顯微鏡圖像工作站-TiE選用Nomarski DIC系統(tǒng)，使用Senarmont法通過旋轉(zhuǎn)起偏器控制檢測相差。每個物鏡轉(zhuǎn)換器內(nèi)安裝物鏡側(cè)棱鏡，同時可配置LWD N1/N2/NR（干）、HNA N2/NR（干/油）型聚光鏡側(cè)棱鏡。

1.5 附件

顯微鏡復(fù)檢包括落射熒光附件、六孔熒光濾色塊轉(zhuǎn)換器、噪聲消除機(jī)制濾色塊、ND4/ND8濾色片和電動六孔熒光濾色塊轉(zhuǎn)換器、電動激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)輪、電動阻擋濾光片轉(zhuǎn)輪等。

2.尼康全自動倒置顯微鏡圖像工作站-TiE的視野矯正

2.1 數(shù)據(jù)采集

分離樣本肝細(xì)胞接種于趨電小室內(nèi)，利用成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞的運(yùn)動。采用maris Track功能，獲取并記錄樣本細(xì)胞在各時間點(diǎn)的原始坐標(biāo)值及靜止各時間點(diǎn)原始坐標(biāo)值。

2.2 數(shù)據(jù)處理

獲得的原始坐標(biāo)值減去第一個時間點(diǎn)獲得的坐標(biāo)值得到振幅，即第n個時間點(diǎn)的振幅=Xn-X1。用同樣的方法完成視野中其他三個時間點(diǎn)的振幅計算，獲得平均振幅。之后以各時間點(diǎn)細(xì)胞的原始坐標(biāo)值減去平均振幅，即可得各時間點(diǎn)細(xì)胞的真實坐標(biāo)值[3,4]。

2.3 真實位移計算

以各時間點(diǎn)細(xì)胞的真實坐標(biāo)值為基礎(chǔ)，獲得細(xì)胞X 方向上的真實位移Dx=Xn-X1（X ：x方向的坐標(biāo)值，n：終點(diǎn)，1：起點(diǎn)）。Y方向上的真實位移Dy=Yn-Y1（Y：y方向的坐標(biāo)值，n：終點(diǎn)，1：起點(diǎn)）。同時在計算過程中，系統(tǒng)會自動將向右的Dx定義為正值，向左的Dx定義為負(fù)值。之后，即可得細(xì)胞從起點(diǎn)到終點(diǎn)的真實位移和真實cosθ=Dx/Td。同時，由于Dx有正負(fù)值，故以細(xì)胞運(yùn)動方向與電場方向相同為正，細(xì)胞運(yùn)動方向與電場方向相反為負(fù)。即cosθ0～1表示細(xì)胞向正極運(yùn)動，運(yùn)動方向與電場方向相反；cosθ-1～0表示細(xì)胞向負(fù)極運(yùn)動，運(yùn)動方向與電場方向相同[5]。

2.4 細(xì)胞運(yùn)動真實軌跡

由于細(xì)胞運(yùn)動軌跡與視野移動軌跡在方向上存在明顯差異，故要活的細(xì)胞真實運(yùn)動軌跡不能直接在視野移動軌跡上加減獲得[6]。因此，活細(xì)胞工作站利用微積分原理，將視野移動軌跡曲線根據(jù)拍攝時間點(diǎn)分為N個片段（N=拍攝時間點(diǎn)，當(dāng)拍攝時間點(diǎn)為60時，N=60）。之后將每隔小線段分解至X 、Y方向再進(jìn)行加減，結(jié)合Dx=Xn-X1、和真實cosθ=Dx/Td。得到Tt=Td1,2+Td2,3+……+Tdn-1,n。獲得細(xì)胞運(yùn)動真實軌跡[7]。

[1]畢曄,張克梅.活細(xì)胞工作站技術(shù)在小鼠卵母細(xì)胞實時觀察中的應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志,2011,29(9):678-679.

[2]安郁寬,閆鵬,徐艷巖.不同孔徑的納米多孔氧化鋁膜對細(xì)胞遷移的影響[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報,2017,39(8):1084-1090.

[3]M Oishi, K Utsubo, H Kinoshita, et al. Continuous and simultaneous measurement of the tank-treading motion of red blood cells and the surrounding flow using translational confocal micro-particle image velocimetry (micro-PIV) with sub-micron resolution[J].Measurement Science & Technology,2012,23(3):1-18.

[4]杜娟,孫劍會,李力,等.活細(xì)胞工作站使用中的視野漂移與矯正[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,37(18):1896-1900.

[5]李婧,尤元義,石慶喜,等.Leica DMI6000B活細(xì)胞工作站的配置及應(yīng)用[J].實驗室研究與探索,2016,35(2):273-276,308.

[7]徐曉靜,張煥相.活細(xì)胞工作站實時攝影技術(shù)在間充質(zhì)干細(xì)胞遷移實驗中的應(yīng)用[J].實驗室科學(xué),2013,16(5):22-24,28.

[8]劉志文,安興,李衡,等.顯微細(xì)胞圖像分析方法的研究進(jìn)展[J].北京理工大學(xué)學(xué)報,2014,34(5):441-453.