17α-甲基睪丸酮誘導(dǎo)白斑狗魚性逆轉(zhuǎn)初步研究

李 飛，胡 瓊，張俊杰

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

白斑狗魚(Esoxlucius)是國(guó)內(nèi)外重要的亞冷水性經(jīng)濟(jì)魚類之一，其生長(zhǎng)速度快，肉質(zhì)堅(jiān)韌，肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，沒有肌間刺，可食部分大，因此深受人們喜愛；且白斑狗魚的市場(chǎng)價(jià)格居高不下，養(yǎng)殖潛力相當(dāng)巨大[1]。研究表明，白斑狗魚雌魚生長(zhǎng)明顯快于雄魚，而且性成熟更晚，壽命更長(zhǎng)[2]。如果能實(shí)現(xiàn)白斑狗魚全雌單性生產(chǎn)，將對(duì)提高白斑狗魚養(yǎng)殖效益有著重要的意義。但是未見用17α-甲基睪丸酮誘導(dǎo)白斑狗魚性逆轉(zhuǎn)的研究報(bào)道。

魚類性別的人工控制方法有很多種，比較常用的幾種方式有雜交育種，性激素處理、雌核發(fā)育、多倍體育種等。當(dāng)然，關(guān)于魚類的單性生產(chǎn)及養(yǎng)殖很多學(xué)者做了這方面的研究，并且取得了一定的成果。河鱸(Percafluviatilis)[3]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[4]、黃鱔(Monopterusalbus)[5]和鯽(Crucianauratus)[6]等魚類用投喂法，溫度調(diào)控誘導(dǎo)法或外源雄激素埋植法數(shù)月后,都獲得了功能性雄魚，即偽雄魚(其自身遺傳物質(zhì)仍為雌魚的)。到目前為止,在魚類的激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中至少在15個(gè)科47種的雌雄異體和9個(gè)科34種的雌雄同體魚類中取得成果,所使用的激素多達(dá)31種，在雄性化誘導(dǎo)中以人工合成的17α-甲基睪酮(17α-MT)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)雄效果最好[7]。用性類固醇激素誘導(dǎo)魚類性轉(zhuǎn)化的研究?jī)?nèi)容分為以下幾個(gè)部分：篩選激素、應(yīng)用的處理方法、處理時(shí)間以及處理強(qiáng)度等[8]。

實(shí)驗(yàn)用的17α-MT對(duì)白斑狗魚雄性化誘導(dǎo)研究主要目的在于了解白斑狗魚性腺分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和17α-MT對(duì)其誘導(dǎo)效果以及是否有嚴(yán)重的致死效應(yīng)，為今后獲得白斑狗魚偽雄魚進(jìn)行全雌魚苗生產(chǎn)(偽雄魚與正常雌魚交配)奠定理論基礎(chǔ)；同時(shí)為魚類繁殖生物學(xué)研究以及白斑狗魚性腺發(fā)育規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用白斑狗魚為2016年4月12日在室內(nèi)經(jīng)人工干法授精，在孵化槽內(nèi)進(jìn)行循環(huán)流水孵化并于2016年4月20日孵出的仔魚。這些仔魚用室內(nèi)循環(huán)流水式系統(tǒng)在水箱(規(guī)格為60 cm×40 cm×30 cm)中養(yǎng)殖，水體日交換過濾次數(shù)為5次，并用增氧機(jī)全天24 h增氧。試驗(yàn)初期水溫在11～12 ℃，出膜后逐漸提高到12～14 ℃，最終提高至18 ℃左右飼養(yǎng)。孵出后4 d左右開始投喂人工孵化的鹵蟲，第10天開始投喂切碎的水蚯蚓，并根據(jù)仔魚的生長(zhǎng)情況，逐漸過渡到不再切碎，一直投喂至試驗(yàn)結(jié)束為止，試驗(yàn)魚每天投喂兩次以保證餌料充足。

1.2 試驗(yàn)藥品及餌料的配制

試驗(yàn)所用17α-甲基睪丸酮購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。17α-MT為白色粉末狀藥品，經(jīng)精密稱定完全溶解于無(wú)水乙醇中配制成1 mg/mL 的原液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，待使用時(shí)只需用水稀釋50倍即可，即達(dá)到試驗(yàn)所需的濃度20 mg/L；試驗(yàn)所需濃度是根據(jù)Yamamoto等[9]建立的有效激素處理標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的。試驗(yàn)組所需投喂的水蚯蚓在20 mg/L 的17α-MT中浸泡1 h即可。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品的處理

試驗(yàn)開始前先將人工孵化的白斑狗魚隨機(jī)選出900尾無(wú)傷無(wú)病的仔魚，平均分成6個(gè)大組每組150尾魚；每個(gè)大組再設(shè)置3個(gè)平行，每組50尾魚；其中4個(gè)大組為試驗(yàn)組，分別在出膜后的第10、20、30、40天投喂經(jīng)20 mg/L 17α-MT浸泡的水蚯蚓，投喂以0.5 h吃完為佳，若未吃完則將剩余餌料及時(shí)吸出，各組投喂的持續(xù)時(shí)間均為30 d，然后轉(zhuǎn)為投喂正常的水蚯蚓；第5組為乙醇對(duì)照組(簡(jiǎn)稱乙醇組)，在出膜40 d后對(duì)其投喂與試驗(yàn)組等量的經(jīng)20 mg/L無(wú)水乙醇浸泡的水蚯蚓，連續(xù)投喂30 d后轉(zhuǎn)為投喂正常餌料；第六組為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱空白組)，始終投喂正常餌料。

所有試驗(yàn)魚在2016年11月10日和12日將存活的仔魚分兩批進(jìn)行解剖并取出性腺，在Bouin’s固定液中固定24 h后用加入少量氨水(去除固定液顏色)的70%乙醇沖洗再轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。

在試驗(yàn)魚飼喂的過程中觀察并記錄各組仔魚的反應(yīng)，尤其是死亡情況及原因。

1.4 組織學(xué)分析

采集的樣品經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，滲蠟，包埋，然后進(jìn)行連續(xù)橫切，厚度為5～7 μm，HE染色，最后用Motic光學(xué)顯微鏡觀察分析并拍照取圖。根據(jù)性腺的組織結(jié)構(gòu)判斷其性別，記錄其性別情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將飼喂期間記錄的各組死亡數(shù)、性腺觀察結(jié)果的性別情況錄入Excel表格；計(jì)算各組雄性率及平均存活率和標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)都用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D)的形式表示。然后用Spss19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用LSD多重比較法檢驗(yàn)各組間仔魚存活率是否有顯著性差異，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組對(duì)白斑狗魚存活率的影響

飼喂白斑狗魚仔魚時(shí)各組魚進(jìn)食情況良好，投喂餌料時(shí)仔魚均競(jìng)相吞食。但在整個(gè)飼喂過程中各組魚均發(fā)生了不同程度的死亡。其中投喂17α-MT的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的仔魚的反應(yīng)基本一致，均表現(xiàn)為一種較空白組稍興奮的狀態(tài)，在箱內(nèi)頻繁快速地游動(dòng)；在激素投喂期內(nèi)箱內(nèi)的少部分仔魚又轉(zhuǎn)變?yōu)檩^空白組安靜地狀態(tài)，食欲不振，甚至停止進(jìn)食，最后安靜的停留在箱底，基本在一周內(nèi)死亡；激素投喂期結(jié)束后繼續(xù)投喂正常餌料，但在飼養(yǎng)過程中試驗(yàn)組均出現(xiàn)了不同程度的畸形魚，有的是脊索彎曲，有的是背鰭部位骨質(zhì)增生，這些魚有的在后期生長(zhǎng)時(shí)又恢復(fù)了正常形態(tài)，有的則在數(shù)天后死亡。乙醇組和對(duì)照組未出現(xiàn)上述的異常情況，但也有一定數(shù)量的死亡，主要死亡原因?yàn)樽恤~間相互追咬(白斑狗魚在幼魚階段有殘食現(xiàn)象)。

所有仔魚在培育至2016年11月12日(7月齡)全部處死取出性腺并統(tǒng)計(jì)各組存活尾數(shù)，計(jì)算各組平均存活率(見表1)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示1、2、3組間存活率無(wú)顯著差異，4組，乙醇組，空白組間存活率無(wú)顯著差異。1組分別與4組和乙醇組；2、3組分別與4組，乙醇組，空白組間存活率存在顯著差異，即在出膜30 d前投喂17α-MT對(duì)其有顯著致死效應(yīng)；乙醇組與空白組間存活率無(wú)顯著差異，即無(wú)水乙醇對(duì)其無(wú)顯著致死效應(yīng)。

表1 不同處理對(duì)各組白斑狗魚平均存活率影響的多重比較表Tab.1 The impact of different treatments on each E.lucius average survival rate of multiple comparison %

注：*表示有顯著差異(P<0.05)

2.2 17α-MT對(duì)白斑狗魚性腺分化及性別比例的影響

將7月齡全部處死取出性腺固定并進(jìn)行組織切片，顯微觀察各組魚性腺發(fā)育情況，判斷每條魚的性別。結(jié)果顯示各組魚的性腺均出現(xiàn)了三種分化現(xiàn)象：?jiǎn)我痪步Y(jié)構(gòu)，單一卵巢結(jié)構(gòu)，精巢卵巢結(jié)構(gòu)混長(zhǎng)(如圖1所示)；由于對(duì)照組乙醇組和實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了這種情況，所以這種情況的出現(xiàn)不是投喂17α-MT導(dǎo)致的，而是白斑狗魚特殊的性腺分化方式所致。根據(jù)觀察到的這三種情況進(jìn)行了分組(雌性，雄性，兼性)，統(tǒng)計(jì)情況如表2所示。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組1(10 d喂藥組)的雄性率40.8%，高于其它各組(10%，8.5%、6.3%、8.2%、26.3%)，說(shuō)明試驗(yàn)組在不同的時(shí)間投喂17α-MT對(duì)其雄性率的影響程度是不同的，在出膜20 d后投喂17α-MT時(shí)其性腺已經(jīng)開始分化，藥物對(duì)其性別分化影響程度小，因此推斷其性腺分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)可能是在出膜后10～20 d。

圖1 各組中白斑狗魚性腺三種分化現(xiàn)象的組織切片F(xiàn)ig.1 The tissue sections for three differentiation phenomenon of E.lucius gonad in each experimental group 1.單一卵巢組織的性腺，示處于第二時(shí)相卵母細(xì)胞。2.單一精巢組織的性腺。3.精巢組織與卵巢組織共存的性腺。 (OC：卵巢腔，TA：性腺被膜，L：精小葉，LL：小葉腔)

組別各組仔魚數(shù)/尾開始喂藥時(shí)間/d喂藥持續(xù)時(shí)間/d最終取樣數(shù)/尾雄性率/%實(shí)驗(yàn)組1150孵化后103049408實(shí)驗(yàn)組2150孵化后203040100實(shí)驗(yàn)組3150孵化后30304785實(shí)驗(yàn)組4150孵化后40306463乙醇組150孵化后40306182空白組150始終投喂正常餌料始終投喂正常餌料57263

在進(jìn)行性腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察時(shí)，同為7月齡的白斑狗魚但其性腺發(fā)育的程度卻存在明顯的差異，主要表現(xiàn)為一些性腺飽滿里面充滿了生殖細(xì)胞(卵母細(xì)胞，精原精母細(xì)胞和精子)，性腺的橫切面積較大；另一些性腺窄小，性腺內(nèi)生殖細(xì)胞少，橫切面積小。性腺窄小的情況主要出現(xiàn)在投喂藥物的4個(gè)試驗(yàn)組，而乙醇組和空白組相對(duì)較為飽滿。在整個(gè)觀察過程中未見有成熟的卵子，大多處于第二時(shí)相卵母細(xì)胞說(shuō)明此時(shí)還未性成熟，并且染色加深有退化跡象；但卻觀察到大量的精原母細(xì)胞和成熟精子(如圖2所示)。

圖2 白斑狗魚卵巢和精巢發(fā)育情況的組織切片F(xiàn)ig.2 The tissue section for ovary and testis development situation of E.lucius1.卵巢中退化的卵母細(xì)胞。2.精巢中各期雄性生殖細(xì)胞。(SG：精原細(xì)胞，SC：精母細(xì)胞，S：精子細(xì)胞) 3.精巢中呈渦流狀分布的精子。S：精子

3 討論

3.1 投喂17α-MT對(duì)白斑狗魚存在顯著致死效應(yīng)

17α-MT是人工合成的雄激素，因其價(jià)格低廉誘導(dǎo)效果佳被廣泛應(yīng)用于魚類雄性化誘導(dǎo)試驗(yàn)中。但有研究指出，性別決定類型為雄性配子異型(XY♂)的魚類其雌魚(XX♀)雄性化后(XX♂)的平均存活率僅為24%，同樣的雌性配子異型(ZW♀)魚類其雄魚(ZZ♂)雌性化后(ZZ♀)的存活率為20%[7]。研究表明，性別表型與遺傳型不一致的魚類生存能力明顯減弱。激素誘導(dǎo)魚類性轉(zhuǎn)化還存在一個(gè)耐受閾值，處理強(qiáng)度在此值內(nèi)對(duì)存活率無(wú)顯著影響，超過這個(gè)值就會(huì)降低存活率[10]。在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[11]和斑馬魚(Daniorerio)[12]的雄性化誘導(dǎo)中均表現(xiàn)為MT處理組存活率明顯低于對(duì)照組，而在七彩神仙魚(S.aequifasciata)[13]的MT雄性化誘導(dǎo)中激素濃度為40、60 mg/kg其濃度明顯高于本試驗(yàn)20 mg/L但對(duì)其存活率沒有顯著影響。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)激素誘導(dǎo)魚類性轉(zhuǎn)化會(huì)造成內(nèi)臟的損傷[14]。

本試驗(yàn)對(duì)白斑狗魚在出膜30 d前投喂17α-MT出現(xiàn)顯著死亡現(xiàn)象分析其原因：第一可能是成功誘導(dǎo)雄性化的仔魚在后天的養(yǎng)殖過程中因?yàn)樯婺芰^弱而死亡；第二激素誘導(dǎo)的強(qiáng)度過大，超過了白斑狗魚的耐受閾值；第三可能是激素處理對(duì)其內(nèi)臟造成了不同程度的損傷，致使其生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)畸形而死亡。出膜40 d投喂組未出現(xiàn)顯著死亡可能是其個(gè)體較大自身的免疫力較強(qiáng)，具體原因有待進(jìn)一步研究。因?yàn)椴煌~類的最優(yōu)誘導(dǎo)強(qiáng)度不同，所以關(guān)于白斑狗魚的雄性化誘導(dǎo)強(qiáng)度有待進(jìn)一步研究。

3.2 各處理組對(duì)白斑狗魚性腺分化的影響

Demska-Zakes等[15]用11β-HA對(duì)白斑狗魚仔魚進(jìn)行雄性化誘導(dǎo)濃度為20 mg/kg和30 mg/kg在105 d后復(fù)查性別出現(xiàn)了13%，17%的兼性(intersexuality)和74%，83%的雄性比例。隨后Luczynski等[16]做了17α-MT對(duì)雌核發(fā)育的白斑狗魚雄性化誘導(dǎo)試驗(yàn)，濃度分別為20,30,60 mg/kg，結(jié)果出現(xiàn)了13%，17%，24%，76%的兼性和16%，76%，77%，87%的雄性比例，由此確定白斑狗魚是雄性配子異型(XY)的染色體性別決定類型并總結(jié)白斑狗魚雄性化誘導(dǎo)的最佳濃度為30 mg/kg，最佳處理魚體長(zhǎng)度是在26～30 mm。以上研究出現(xiàn)兼性的原因主要有兩點(diǎn)：第一激素處理強(qiáng)度過大主要表現(xiàn)為激素濃度過高，第二在誘導(dǎo)時(shí)性腺已經(jīng)開始分化。本試驗(yàn)中對(duì)照組與試驗(yàn)組均出現(xiàn)了不同程度的兼性，而以上研究對(duì)照組未出現(xiàn)兼性現(xiàn)象。分析試驗(yàn)組出現(xiàn)兼性的原因也有兩點(diǎn)：第一白斑狗魚性腺的自然分化過程就存在兼性現(xiàn)象，第二激素處理強(qiáng)度過大主要表現(xiàn)為處理持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)。

白斑狗魚在食物充足的自然水體中雄魚產(chǎn)生精子在1齡，雌魚卵母細(xì)胞開始積聚卵黃在2齡，體長(zhǎng)在29～36 cm[17]。本試驗(yàn)白斑狗魚在7月齡性腺處于不成熟階段，但雄魚產(chǎn)生了精子，說(shuō)明17α-MT促進(jìn)了生殖細(xì)胞的發(fā)展。劉少軍[18]在對(duì)革胡子鯰(Clariaslazera)雄性化誘導(dǎo)中指出MT對(duì)精巢具有雄性催熟作用。喂藥的四個(gè)試驗(yàn)組中的雌性仔魚性腺的橫切面積較小，卵母細(xì)胞個(gè)體較小數(shù)量較少，其原因可能是MT在對(duì)精巢具有雄性催熟作用的同時(shí)對(duì)卵巢的發(fā)育具有一定的抑制作用，趙春剛等[19]在斑馬魚性腺發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)外源雄性激素對(duì)雌性斑馬魚的性腺發(fā)育影響明顯，較高劑量時(shí)可導(dǎo)致外源激素的閹割作用。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，除試驗(yàn)組1外其它各試驗(yàn)組的雄性率相差不大并且與乙醇組雄性率較為接近(10%，8.5%，6.3%，8.2%)，但均表現(xiàn)出低于空白組雄性率(26.3%)。那么反之就是實(shí)驗(yàn)2、3、4組和乙醇組的雌性率與兼性率之和要高于空白組的雌性率與兼性率之和，分析其原因有兩點(diǎn)：第一20 d后喂藥組對(duì)其轉(zhuǎn)雄的作用由于性腺已經(jīng)開始分化而減弱，使其產(chǎn)生了更多的兼性和雌性；第二是無(wú)水乙醇也具有一定的雄性化作用，但由于未達(dá)到適宜的濃度和作用時(shí)間點(diǎn)使其轉(zhuǎn)雄的作用減弱而產(chǎn)生了更多的兼性和雌性。陳本德[20]在MT誘導(dǎo)雌核發(fā)育鯽魚雄性化研究中通過3年的重復(fù)試驗(yàn)證明了1 mL/g的95%工業(yè)酒精能使雌核發(fā)育鯽魚60%～84.6%成功轉(zhuǎn)雄。但是關(guān)于酒精對(duì)性腺分化影響的研究較少，本試驗(yàn)的乙醇對(duì)照具體作用原因還有待進(jìn)一步研究。

3.3 白斑狗魚特殊的性腺分化方式

硬骨魚類性腺分化方式多種多樣。主要可分為三大類：雌雄同體、雌雄異體、兼性。而雌雄同體又可分為連續(xù)型雌雄同體和同步性雌性同體；雌雄異體也可分為兩種，分化型雌雄異體和未分化型雌雄異體，需要注意的是未分化型雌雄異體又表現(xiàn)出兩種不同的類型,雄性先熟型和雌性先熟型[21-22]。兼性是指性腺中既含有精巢組織又含有卵巢組織只是各自所占的比例不同，并且能夠產(chǎn)生有活性的卵子或精子[22]。兼性是雌雄異體魚類中一種少見的現(xiàn)象，在野生種群中兼性的概率僅為0.02，目前認(rèn)為出現(xiàn)兼性的原因?yàn)榄h(huán)境因子對(duì)性腺的影響或是性腺內(nèi)生殖細(xì)胞的變異[21]。

Maack等[23]對(duì)斑馬魚(Daniorerio)性腺分化組織學(xué)形態(tài)學(xué)研究表明，仔魚在5周齡時(shí)有87%的魚性腺分化處于核仁周邊期卵母細(xì)胞，而從5周齡開始一些魚性腺中卵母細(xì)胞數(shù)量減少尺寸變小嗜堿性增強(qiáng)，最終退化,在11周齡有40%的性腺發(fā)育為早期精巢?；始医z鱸(Grammaloreto)[24]性腺分化方式也與此類似,并且它們的性腺分化方式都屬于未分化型雌雄異體。

本試驗(yàn)中各組白斑狗魚性腺中均出現(xiàn)了精巢組織與卵巢組織共存的現(xiàn)象，并且7月齡的白斑狗魚性腺中的卵母細(xì)胞均處于第二時(shí)相卵母細(xì)胞。在試驗(yàn)組與對(duì)照組中均觀察到不同程度的卵母細(xì)胞染色加深(嗜堿性增強(qiáng))發(fā)生皺縮，說(shuō)明卵母細(xì)胞有退化的跡象，可能在向精巢發(fā)展。這種分化現(xiàn)象與以上研究結(jié)果類似，由此判斷白斑狗魚性腺分化方式可能也屬于未分化型雌雄異體型。作者在進(jìn)行白斑狗魚雄性化誘導(dǎo)試驗(yàn)的同時(shí)也進(jìn)行了白斑狗魚性腺自然分化規(guī)律的研究(另文發(fā)表)，結(jié)果表明在性腺分化過程中確實(shí)存在大量的類卵巢結(jié)構(gòu)，在196 d時(shí)出現(xiàn)大量的精巢組織與卵巢組織共存的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明用經(jīng)濃度為20 mg/L 17α-MT浸泡的餌料連續(xù)投喂30 d對(duì)白斑狗魚有明顯的致死效應(yīng)；在進(jìn)行性腺的組織學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)白斑狗魚的性腺分化存在一個(gè)兼性的分化過程，這種分化類型的特點(diǎn)與未分化型雌雄異體魚類相吻合。對(duì)于未分化型雌雄異體魚類性別控制由于其性別分化的特殊性，在性別分化時(shí)存在一個(gè)自身的性別轉(zhuǎn)化過程，如果要成功地控制其性別比例就要找到其雌性和雄性轉(zhuǎn)變的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，在這個(gè)分化的節(jié)點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行激素誘導(dǎo)方可獲得較好的效果。白斑狗魚的性腺分化轉(zhuǎn)雄的時(shí)間節(jié)點(diǎn)應(yīng)該在出膜后10-20 d。

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