分子診斷技術在乳品酵母菌數檢測中的研究進展

常江，李暢，趙柯，關玉婷，孟憲梅，胡盼，孫宇，宿甲子，李巖松，柳增善

（1.吉林工商學院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，長春1305071；2.人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林大學人獸共患病研究所，吉林大學動物醫(yī)學學院，長春130062）

0 引 言

微生物污染導致的食源性疾病是食品安全中的最重要問題之一[1]。乳品營養(yǎng)豐富，微生物污染會導致短時間內污染嚴重超標，降低乳品品質并引起變質、脹袋等，其中酵母菌污染是引起發(fā)酵乳脹袋、變質的主要原因[2]。乳品中常見酵母菌包括馬克斯克魯維酵母菌、庫德里阿茲威氏畢赤酵母、熱帶假絲酵母等[3]，其酵母總數是評定食品污染程度的標志，具有重要的衛(wèi)生學意義。

1 酵母菌的國標檢測方法

平板計數法是酵母菌計數的國標檢測方法。GB4789.15-2016[4]規(guī)定，樣本均質后經10倍系列稀釋加入含有氯霉素的土豆-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基或在孟加拉紅固體培養(yǎng)基中進行平板培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)5 d后菌落計數。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖操作容易、成本低廉，但檢測周期長、程序復雜，不利于企業(yè)篩查，遠遠不能滿足現代檢測的需要[5]。因此，近年來國內外對酵母菌的檢測方法進行了新的探索。

2 酵母菌的分子診斷技術

分子生物學檢測方法是現代致病微生物檢測的核心技術[6]。隨著分子生物學的不斷發(fā)展和應用，分子診斷技術成為酵母菌檢測最重要的組成部分[3]，主要包括核酸擴增技術和分子免疫學技術兩類。

2.1 核酸擴增技術

2.1.1 PCR方法

分子生物學檢測方法是現代致病微生物檢測的核心技術,尤以PCR技術為代表[6]。PCR是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術，該方法具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點，且特異性擴增產物可以通過26S測序鑒定，在8 h內診斷乳品中酵母菌種類[7]。常規(guī)PCR對酵母菌的檢測限為106CFU/m L，進行DNA純化后檢測限提升至103CFU/m L[8]，但國標法要求乳品中酵母菌的檢出率僅為102CFU/m L[4]。為了提升PCR擴增靈敏度，很早就有人提出了用巢氏PCR代替普通PCR進行檢測，該方法相比普通PCR大大提升檢測靈敏度[9]，但由于需要在第二輪PCR時進行開蓋操作，巢氏PCR在提升檢測限的同時也增加了污染的機會，造成實際樣本中的假陽性增加。

2.1.2 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（LAM P）是一種新型的核酸擴增技術，近年來主要用于細菌和病毒檢測，對真菌的研究也有報道[10]。該方法對儀器設備要求低，僅需恒溫擴增，具有反應速度快，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點，酵母菌最低檢測限為103CFU/m L[11]。其結果可以通過瓊脂糖凝膠電泳反映，粗略時可眼觀觀測。但由于LAM P的封閉系統(tǒng)較差，開蓋后電泳檢測極易產生“氣溶膠”污染，因此造成假陽性是該方法的主要問題。LAM P-LFD方法在LAM P基礎上結合橫向流膠體金試紙條技術，對LAM P進行了改進。一方面省略了瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟，另一方面減少樣本污染。該方法提高了檢測準確性，檢測時長大約50min，靈敏度是普通PCR方法的100倍[12]，受到國內外廣泛關注和認可。

2.1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative Real-tim e PCR）是一種通過熒光染料或特異性熒光探針對PCR產物進行標記跟蹤，實時監(jiān)測反應過程，并結合相應軟件分析產物及模板的分子生物學技術[3]。與上世紀90年代的終點PCR法相比，實時熒光定量PCR具有特異性更好、靈敏度更高、線性關系好、定量準確等的優(yōu)勢，成為酵母菌檢測的一大突破，是當前酵母檢測中的最為普遍的檢測方法[3]。實驗研究發(fā)現，盡管果汁等食品中的酵母菌以及常見腐敗細菌的檢測結果多會受食品成分及種類的影響而發(fā)生不穩(wěn)定改變[13]，但乳品中酵母菌的檢測并未受到乳品成分的影響[14]。因此，乳品中酵母菌檢測可以不依賴于DNA提取，這對用熒光定量PCR方法直接檢測乳品中酵母菌數的準確性提供了重要依據。

人們根據酵母菌檢測目的對其引物進行了深度分析與探索。目前主要包括真菌通用引物[13]、酵母菌通用引物[16]以及特定酵母菌引物[17]的PCR檢測。Kurtzm an和R obm ett等對所有已知酵母菌株測序分析發(fā)現，26S rDNA D 1/D 2區(qū)存在中間變異較大但種間變異小于1%的1 600 bp片段，這一片段經分析驗證最終被國際酵母分類學界所普遍接收[16]。因此，目前常用酵母菌檢測引物多以此片段為模板。其中存在26S rDNA D 1/D 2真菌通用引物N L1/N L4[18]可以進行9種酵母菌及霉菌的通用檢測，靈敏度103～108CFU/m L，(但引物存在二聚體，不適用酵母菌的準確定量；另酵母菌ITSI通用引物在26S rDNA D 1/D 2區(qū)設計，檢測線最低可達2～22 CFU/m L[19]。除此之外，酵母菌通用引物也包括18S rDNA[20]特異性引物及酵母肌動蛋白基因[21]檢測等，能檢測101CFU/m L純酵母菌。熒光定量PCR在檢測過程中采用絕對定量方法，需要注意，操作過程容易出現質粒擴散而導致假陽性[22]，實驗過程應保持通風并及時關閉管蓋，最大程度降低假陽性。

2.1.4 PM A/EM A-qPCR

傳統(tǒng)熒光定量PCR受限于無法區(qū)分細胞死活[23]。因此，即使酵母菌死亡，裸露的DNA也可以持續(xù)存在于環(huán)境中，使得熒光定量PCR的檢測結果高估病原體濃度，導致實際樣本檢測結果不準確。

PM A/EM A是一種DNA嵌入染料，能夠穿透死細胞的受損細胞膜，可以通過曝光結合細胞外暴露DNA及非存活細胞的DNA，并阻止DNA在隨后的PCR反應中被擴增[24]。由于存在顆粒及抑制劑抑制PM A/EM A與DNA的交聯作用，因此只有少部分文獻[25]報道了使用PM A/EM A-qPCR進行乳品中酵母菌的檢測。但實驗研究表明，與qPCR相比，PM A/EM A-qPCR對酵母菌的檢測結果與國標法結果相近且呈現高度的線性相關，檢測結果達到國標法檢測要求[3]，說明該方法確實可以通過優(yōu)化達到篩選目的，是一種很有前景的酵母菌檢測方法。

2.1.5 RT-qPCR

酵母菌rRNA的RT-qPCR于2006年首次被提出。該方法檢測限為10 CFU/m L，檢測限低，具有實時熒光定量PCR（qPCR）能夠快速檢測和定量酵母菌數而不需要培養(yǎng)的優(yōu)勢，且因為死細胞沒有被量化而使結果更加準確[26]。因此該方法是一種對酵母進行快速、準確檢測的技術，可以更準確的控制腐敗風險[27]。為評估熱致死處理的酵母菌RNA穩(wěn)定性的影響，N uria H ierro等人通過熱處理后肌動蛋白RNA和DNA實驗比較發(fā)現，熱處理10 min后的12 h，經熱致死處理的酵母m RNA穩(wěn)定性較差，可能導致樣品量化過程中酵母菌含量被低估。但rRNA和rDNA均穩(wěn)定存在，26S rRNA可能與細胞活力相關，從而產生限制其立即降解的能力。細胞生理狀態(tài)不同可能存在定量過程中基因表達差異問題，但經實驗分析，這種差異不顯著[26]。因此，RT-qPCR方法是檢測乳品中酵母菌數的可靠方法。

2.1.6 自動化平臺

自動化分子平臺的出現突破了PCR傳統(tǒng)空間限制，實現了樣本提取、擴增、檢測一體式方案，有效避免PCR污染難題[28]。該技術具有超前的樣品制備系統(tǒng)、獨特的PCR反應系統(tǒng)和封閉的內部質控。一方面，具有操作方法簡單、結果穩(wěn)定、花費時間短，總時間僅需30min的優(yōu)點；另一方面，該技術確保安全性，技術一體化大大降低檢測人員與病原體的接觸幾率，保護檢測人員安全[29]。目前常見的自動化平臺有GeneXpert快速檢測系統(tǒng)、Am pliPrepTM/COBAS?Taqm an系統(tǒng)等，主要用于流行疾病監(jiān)控和臨床檢測。盡管該技術存在成本較高、便攜性較差的短板，但隨著經濟發(fā)展和研究進步，自動化平臺的應用將更為廣闊[30]。

2.2 分子免疫技術

2.2.1 流式細胞技術

流式細胞技術（FCM）是一種使用流式細胞儀對液相中懸浮細胞及微粒測量的自動化檢測技術[31]。流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞進行多參數、快速的定量分析。通過熒光標記、富集并將微生物細胞注入流式細胞儀的石英流式細胞柱，確保單個微生物細胞經過激光激發(fā)柱，經儀器分析及計算機計算得出樣本酵母菌數[32]。隨著分子免疫學、細胞生物學及電子計算機技術的迅速發(fā)展，流式細胞技術成為一種對生物粒子進行結構、功能及作用檢測的重要儀器技術[33]。伴隨該方法對酵母菌檢測的使用，具有可檢測出單個活酵母細胞的巨大優(yōu)勢，相比其他方法檢測限不夠而引入的增菌等方法，減少了工作量并增加檢測準確性[34]。該技術檢測需90～100min，已用于水、飲料、牛奶及其他液態(tài)加工食品等多個行業(yè)。為防止阻塞進樣通道，流式細胞技術的所有樣本均需進行前處理[35]，且由于流式細胞儀設備昂貴，該方法目前還未能在企業(yè)檢測中普及使用。

2.2.2 雙抗夾心ELISA方法

雙抗夾心ELISA方法是酵母檢測的分子免疫學方法。該方法特異性好、靈敏度高，在細菌檢測中廣泛使用[36-37]，但由于酵母菌相對細菌而言菌體很大，包被、捕獲及檢測過程中極易造成損失，致使實際檢測結果偏低，使用抗活酵母細胞的多克隆抗體的ELISA技術對乳制品中腐敗酵母物種的檢測和計數是有限的[20]。酵母菌的ELISA檢測方法主要用于檢測酵母菌體蛋白，建立方法穩(wěn)定性良好，精確度高，特異性強，最低檢測限可達到6.25 ng/m L，常用于大量樣本的酵母殘留檢測[38]。

2.2.3 膠體金免疫層析法

免疫膠體金技術(Imm une colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體中的一種新型的免疫標記技術[39]。酵母菌抗原在隨測試帶移動時與膠粒的檢測物——抗酵母菌抗體復合物相互作用，形成的復合體持續(xù)流向檢測區(qū)域固定的特異性酵母菌抗體，形成一道藍線，該藍線反映了酵母菌檢測線（T線）的陽性結果，膠粒與其他特異性抗體反應的質控線（C線）反映檢測功能正常[40]。該方法與國標培養(yǎng)法相比，敏感度為86%，特異度為94%，精確度為90%，檢測時間在20 min以內，是臨床診斷中一個重大的進步，對于特定分類酵母菌的檢測有重要的參考價值。

3 結 論

微生物污染是食品安全中最重要的問題之一，是評價食品安全性的重要指標[41]。酵母菌污染是引起發(fā)酵乳脹袋、變質的主要原因，酵母菌數是評定食品污染程度的標志。國標法對于乳品中酵母菌的檢測操作繁瑣、耗時長，遠遠不能滿足現代檢測的需求。

分子診斷技術主要包括核酸擴增技術和分子免疫學技術兩類。這些檢測方法與平板計數法相比，具備靈敏度強、準確性高、操作簡便等優(yōu)點，可以為乳品中酵母菌檢測提供更及時、有效的檢測結果，是目前酵母菌檢測的核心技術。其中熒光定量PCR及其改進技術具有高靈敏度、準確性、穩(wěn)定性的優(yōu)勢，且乳品環(huán)境不會干擾擴增結果，是企業(yè)首選的檢測方法。此外，對于酵母菌的檢測方法一方面傾向于方便、快捷、人性化，因此膠體金試紙條與各類檢測方法的聯合使用受到廣泛關注；另一方面，盡管以流式細胞技術為代表的新型檢測方法存在成本較高的問題有待進一步解決，但隨著科技水平的進步，這些新的分子生物診斷技術檢測結果更加精準，功能更加多樣，將在食品行業(yè)、公共衛(wèi)生領域具有更為廣闊的應用前景。