質(zhì)譜快速鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的方法研究

宋啟飛，劉敏雪，李夢嬌，劉雅，鄧勁，謝軼

（四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041）

血培養(yǎng)可有效檢測出導(dǎo)致血流感染的病原菌，是臨床診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。在菌血癥、膿毒血癥等嚴(yán)重感染患者中，及早使用敏感抗菌藥物可有效降低患者的病死率[4]。有研究顯示，血流感染病原菌鑒定報告時間每延遲1 h，患者存活率降低7.6%[5]。然而，目前的血培養(yǎng)檢驗流程中，血培養(yǎng)瓶報陽后，仍需36～48 h才能得到最終的菌種鑒定報告。本研究嘗試摸索一種血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的快速、精準(zhǔn)鑒定方法，以縮短血培養(yǎng)陽性的周轉(zhuǎn)時間（turnaround time,TAT），為臨床醫(yī)生提供更為及時、精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集2016年7月—2016年11月四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床送檢的非重復(fù)的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本91份?；钚蕴垦囵B(yǎng)瓶（法國生物梅里埃公司），血平板（鄭州安圖生物技術(shù)有限公司），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），基質(zhì)液HCCA（德國Bruker Daltonic公司），75%酒精，75%甲酸。

1.2 儀器與設(shè)備

Bact/Alert 3D血培養(yǎng)儀（法國生物梅里埃公司），MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)（德國Bruker Daltonic公司），二氧化碳孵箱（日本三洋公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海恒一精密儀器有限公司），高速離心機（深圳市科力易翔儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血培養(yǎng)陽性標(biāo)本處理 將91份血培養(yǎng)陽性標(biāo)本（活性炭血培養(yǎng)瓶）放入Bact/Alert 3D血培養(yǎng)儀，系統(tǒng)自動孵育和檢測，陽性報警時取出血培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶口，抽取陽性瓶內(nèi)培養(yǎng)液進行涂片和革蘭染色。將血培養(yǎng)陽性瓶中的培養(yǎng)液分別轉(zhuǎn)種至肉湯和血平板。將100μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至2 ml肉湯管中混勻，振蕩孵育4 h，37℃、220 r/min離心，作為肉湯增菌組；同時將100μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至血平板，5%～10%二氧化碳孵箱，37℃培養(yǎng)4 h，作為血平板培養(yǎng)組；同時分別轉(zhuǎn)種另一塊血平板，5%～10%二氧化碳孵箱，37℃培養(yǎng)24 h，作為對照組。

1.3.2 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time-offlight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）鑒定 ① 4 h肉湯增菌法：取經(jīng)4 h增菌培養(yǎng)的肉湯1 ml至EP管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，取EP管底部1μl細(xì)菌沉淀，制備質(zhì)譜靶板；②4 h血平板培養(yǎng)法：挑取經(jīng)4 h血平板培養(yǎng)的菌膜1μl制備質(zhì)譜靶板。室溫干燥后，進樣至MALDI-TOF MS系統(tǒng)中進行菌種鑒定。用IVD細(xì)菌測試標(biāo)準(zhǔn)品進行質(zhì)譜分析前儀器參數(shù)校正，質(zhì)譜鑒定操作按照質(zhì)譜儀標(biāo)準(zhǔn)程序進行；③對照組：取培養(yǎng)24 h的血平板上菌落，按上述方法進行質(zhì)譜鑒定，將鑒定結(jié)果作為對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用四格表χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種方法的細(xì)菌質(zhì)譜鑒定結(jié)果總符合率比較

4 h肉湯增菌法的質(zhì)譜鑒定到種的符合率為46.15%（42/91），4 h 血平板培養(yǎng)法為 89.01%（81/91），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=38.146，P=0.000），4 h血平板培養(yǎng)法細(xì)菌質(zhì)譜鑒定到種的符合率高于4 h肉湯增菌法。4 h肉湯增菌法中43株菌無質(zhì)譜鑒定結(jié)果，占47.25%，3株菌質(zhì)譜鑒定錯誤，占3.30%。4 h血平板培養(yǎng)法中3株菌無質(zhì)譜鑒定結(jié)果，占3.30%，4株菌質(zhì)譜鑒定錯誤，占4.40%。2種方法無鑒定結(jié)果率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=46.547，P=0.000），4 h血平板培養(yǎng)法的無鑒定結(jié)果率低于4 h肉湯增菌法。2種方法錯誤鑒定率比較，經(jīng)Fisher確切概率法分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.500）。

2.2 2種方法對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的鑒定結(jié)果比較

91例血培養(yǎng)陽性瓶中，分離出革蘭陽性菌40株，革蘭陰性菌51株。40株革蘭陽性菌中，4 h肉湯增菌法質(zhì)譜鑒定到種的符合率為30.00%（12/40），4 h血平板培養(yǎng)法質(zhì)譜鑒定到種的符合率為82.50%（33/40）。51株革蘭陰性菌中，4 h肉湯增菌法質(zhì)譜鑒定到種的符合率為58.82%（30/51），4 h血平板培養(yǎng)法質(zhì)譜鑒定到種的符合率為94.12%（48/51）。4 h血平板培養(yǎng)法對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌鑒定到種的符合率與4 h肉湯增菌組比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.943和17.654，P=0.026和0.000），4 h血平板培養(yǎng)法對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌鑒定到種的符合率高于4 h肉湯增菌法。

2.3 2種方法對腸桿菌科細(xì)菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

革蘭陰性菌中腸桿菌科細(xì)菌41株，經(jīng)4 h肉湯增菌后質(zhì)譜正確鑒定到種28株，占68.29%（28/41）；經(jīng)4 h血平板培養(yǎng)后質(zhì)譜正確鑒定到種41株，占100.00%（41/41）。4 h血平板培養(yǎng)法與4 h肉湯增菌法鑒定到種的符合率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.449，P=0.000），4 h血平板培養(yǎng)法鑒定到種的符合率高于4 h肉湯增菌法。

2.4 2種方法對其他常見菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

6株鮑曼不動桿菌和5株金黃色葡萄球菌在4 h肉湯增菌法中均未鑒定出結(jié)果，在4 h血平板培養(yǎng)法中全部鑒定到種。在凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌和念珠菌中，4 h血平板培養(yǎng)法的鑒定符合率也高于4 h肉湯增菌法（χ2=18.114，P=0.000）。2種方法對1株具核酸桿菌和1株咽峽炎鏈球菌在4 h增菌后均未鑒定成功，但對1株產(chǎn)單李斯特菌，4 h肉湯增菌法可鑒定到種，4 h血平板培養(yǎng)法可鑒定到屬。

3 討論

近年來新發(fā)展起來的MALDI-TOF MS相對傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定流程，可以更快速、準(zhǔn)確地鑒定出血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的細(xì)菌，縮短血培養(yǎng)陽性的實驗TAT時間，為臨床醫(yī)生提供更為及時的用藥指導(dǎo)。血培養(yǎng)送檢規(guī)范中要求在抗生素使用前進行血液采集，然而在菌血癥、膿毒血癥等嚴(yán)重感染的救治過程中患者可能已使用抗生素，之后才采集血培養(yǎng)。采集的血液中含有抗生素會降低血培養(yǎng)陽性率[6]。因而，血培養(yǎng)瓶中往往添加抗生素吸附劑（如樹脂或活性炭），可有效吸附一定量的抗生素，從而提高血培養(yǎng)陽性率。然而，血培養(yǎng)瓶中的活性炭成分會干擾質(zhì)譜的鑒定結(jié)果，不利于血培養(yǎng)陽性瓶中病原菌的質(zhì)譜鑒定。本研究嘗試用MALDI-TOF MS對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)肉湯和血平板增菌4 h后直接質(zhì)譜鑒定，摸索血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的質(zhì)譜快速鑒定流程，為臨床縮短血培養(yǎng)陽性標(biāo)本病原菌鑒定時間提供參考方法。

本研究血培養(yǎng)陽性標(biāo)本檢出的細(xì)菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及表皮葡萄球菌占前3位，是患者感染最普遍的細(xì)菌。腸桿菌科細(xì)菌和凝固酶陰性葡萄球菌比例與高麗欽[7]、徐修禮[8]等的報道基本一致。腸桿菌科細(xì)菌、葡萄球菌是菌血癥和敗血癥的主要病原菌[7]。本研究探索的4 h血平板培養(yǎng)法對腸桿菌科細(xì)菌鑒定到種的符合率達100.00%（41/41），對凝固酶陰性葡萄球菌鑒定到種的符合率也可達83.33%（20/24）。該方法能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出腸桿菌科細(xì)菌，對臨床醫(yī)生避免經(jīng)驗用藥，減少患者并發(fā)癥，提高治愈率具有重要的臨床意義。

2種方法對革蘭陰性菌鑒定符合率均優(yōu)于革蘭陽性菌，與國內(nèi)外研究報道基本一致[9-12]。其原因可能與革蘭陰性菌比革蘭陽性菌更易生長，革蘭陽性菌對生長條件要求苛刻，不易生長等因素有關(guān)。6株鮑曼不動桿菌和5株金黃色葡萄球菌在4 h肉湯增菌后均未鑒定出結(jié)果，但在4 h血平板培養(yǎng)后全部鑒定成功，可能是血平板相比肉湯，更有利于鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌的生長和質(zhì)譜鑒定，需進一步實驗予以證實。

運用MALDI-TOF MS對細(xì)菌進行鑒定時，細(xì)菌培養(yǎng)基類型、樣品制備方法、離心速度、分析軟件等的標(biāo)準(zhǔn)不一樣，會對細(xì)菌質(zhì)譜鑒定的結(jié)果產(chǎn)生影響[13，14]。本研究中，4 h肉湯增菌法的細(xì)菌質(zhì)譜鑒定符合率較低，這可能與肉湯培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（如蛋白質(zhì)）、培養(yǎng)基性質(zhì)及培養(yǎng)方式有關(guān)，還需進一步改善該方法的實驗流程。

本研究中，4 h血平板培養(yǎng)法細(xì)菌質(zhì)譜鑒定到種的總符合率為89.01%，可快速鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的病原菌，并有高鑒定符合率。但本研究存在一定局限性，僅收集91例樣本，樣本量過少，可能對結(jié)果產(chǎn)生偏移，需增加樣本數(shù)量及菌種的多樣性。而該方法對腸桿菌科、葡萄球菌等生長較快的細(xì)菌快速鑒定更具優(yōu)勢，對有特殊培養(yǎng)要求的革蘭陽性菌等的鑒定符合率相對較低。