DCE-MRI評(píng)估索拉非尼抑制兔VX2肝種植瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究

潘江洋， 時(shí)高峰， 王琦， 王麗佳， 張寧， 黃寧

近年來(lái)，抗腫瘤血管生成治療成為研究的熱點(diǎn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與受體結(jié)合后，能有效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤血管的形成，并為侵襲周?chē)M織和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，通過(guò)抑制Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞表面激酶受體，如內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板衍生因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)等，從分子水平阻斷腫瘤新生血管的形成，是肝癌治療的新選擇[1]?？寡苌芍委熓鼓[瘤缺血壞死，在治療早期腫瘤的大小變化往往不明顯，缺乏有效的影像評(píng)估手段。MR動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描成像(dynamic contrast enhanced MRI,DCE-MRI)在提供常規(guī)MR圖像的同時(shí)，還可提供腫瘤組織內(nèi)部血流灌注信息，常用于腫瘤療效的評(píng)估[2]。本研究以兔VX2肝種植瘤為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該模型腫瘤血供豐富，旨在探討DCE-MRI定量參數(shù)評(píng)估索拉非尼抑制血管生成的能力。

材料與方法

1.兔VX2肝種植瘤模型制作

兔VX2瘤株購(gòu)自東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康新西蘭大白兔45只，體重(3.2±0.5) kg/只，雌雄不限，普通級(jí)，均購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新西蘭大白兔由單個(gè)兔籠飼養(yǎng)，用衛(wèi)生水及標(biāo)準(zhǔn)兔飼料喂養(yǎng)。術(shù)前禁食12 h，剝離荷瘤兔腫瘤，切取生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣組織，制成體積為1 mm3的瘤組織塊備用，采用1%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，開(kāi)腹直視下將兔VX2腫瘤組織塊種植于肝葉內(nèi)，建立兔VX2肝種植瘤模型，術(shù)后7 d行MR常規(guī)掃描(包括T1WI和T2WI序列)，腫瘤模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為肝內(nèi)腫瘤直徑≥0.7 cm。45只新西蘭兔中2只肝臟未見(jiàn)成瘤，5只在行MRI掃描前因麻醉意外死亡，2只在飼養(yǎng)過(guò)程中死亡，成功造模36只，造模成功率80%。選取瘤灶形狀規(guī)則、大小基本一致的30只兔肝種植瘤模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，腫瘤平均直徑為(1.09±0.11) cm。

2.實(shí)驗(yàn)分組及抗血管生成治療實(shí)驗(yàn)

將篩選后的30只兔肝種植瘤模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=15)和對(duì)照組(n=15)。術(shù)后第8天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組每日使用索拉非尼(BAYER公司)進(jìn)行灌胃治療，劑量為30 mg/kg/d；對(duì)照組每日使用5%葡萄糖進(jìn)行灌胃，劑量為30 mg/kg/d，共給藥14 d。分別在治療前、治療后第7天、治療后第14天(即術(shù)后第7、14、21天)行MRI常規(guī)掃描和DCE-MRI掃描。

3.檢查方法

MRI掃描采用Siemens 3.0 Tim skyra 磁共振掃描儀，膝關(guān)節(jié)線圈。常規(guī)MRI掃描前，使用戊巴比妥鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行麻醉，劑量為1.5 mg/kg，麻醉滿(mǎn)意后將實(shí)驗(yàn)兔仰臥于膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)，為減少腹部呼吸運(yùn)動(dòng)使用腹帶加壓包扎，分別行T1WI、脂肪抑制T2WI及DCE-MRI掃描，掃描范圍從膈頂至腎臟下極水平。T1WI掃描參數(shù)：TR 790 ms，TE 18 ms，層厚2.5 mm，層間距0.25 mm， 視野130 mm×130 mm，矩陣320×240。T2WI掃描參數(shù)：TR 4010 ms，TE 73 ms，層厚3 mm，層間距0.3 mm， 視野130 mm×130 mm。 DCE-MRI掃描對(duì)比劑為釓雙胺注射液(Gd-DTPA-BMA，歐乃影) ，將Gd-DTPA-BMA 稀釋在0.9%的生理鹽水中配制成濃度為0.05 mmol/mL的注射液 ，按照0.30 mmol/kg的劑量進(jìn)行注射，采用高壓注射器經(jīng)耳緣靜脈注入，注射流率1 mL/s。DCE-MRI進(jìn)行矢狀面掃描，采用T1加權(quán)的容積式插入法屏氣檢查(volumetric interpolated breath-hold examination，VIBE)序列，時(shí)間分辨力約為2.1 s，掃描參數(shù)：TR 5.51 ms，TE 2.46 ms，層厚3.0 mm，層間距0.6 mm，視野274 mm×341 mm，翻轉(zhuǎn)角12°，矩陣320×194，平掃使用5°、10°、12°、15°翻轉(zhuǎn)角行T1WI掃描，對(duì)比劑注射后，使用12°翻轉(zhuǎn)角掃描獲得無(wú)中斷的67期動(dòng)態(tài)圖像，掃描時(shí)間為144 s。

4.圖像處理

將MR灌注圖像調(diào)入GE Omni-Kinetics灌注軟件。首先，對(duì)圖像進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校準(zhǔn)，以減少呼吸運(yùn)動(dòng)的影響，使用3D非剛性配準(zhǔn)(free form deformation，F(xiàn)FD) 模式，將校準(zhǔn)后的圖像調(diào)入軟件，并按以下步驟處理灌注數(shù)據(jù)：①AIF(動(dòng)脈輸入函數(shù))勾畫(huà)和擬合，在血管較清晰的情況下，勾畫(huà)腹主動(dòng)脈及肝門(mén)靜脈的ROI，ROI的直徑以不超過(guò)相應(yīng)血管直徑的2/3為宜。選擇肝臟雙輸入模型，點(diǎn)擊“curving”得到兩個(gè)輸入血管的時(shí)間-濃度曲線并進(jìn)行擬合；②選擇雙室Tofts模型。選擇病灶的最大層面，點(diǎn)擊“Calculate”進(jìn)行計(jì)算；③選擇病灶圖像最大層面的強(qiáng)化明顯區(qū)域?yàn)镽OI，每個(gè)病灶勾畫(huà)3～4個(gè)ROI(ROI范圍為60～90像素)，勾畫(huà)ROI時(shí)應(yīng)避開(kāi)腫瘤可見(jiàn)的壞死區(qū)、強(qiáng)化的血管等，點(diǎn)擊“report”，得到ROI的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(volume translate constant，Ktrans)、速率常數(shù)(reverse reflux rate constant，Kep)、血管外細(xì)胞外容積分?jǐn)?shù)(extravascular extracellular volume fraction，Ve)和血漿容積分?jǐn)?shù)(volume fraction of the plasma，VP)。為了減少誤差，對(duì)每個(gè)病灶的ROI進(jìn)行3次測(cè)定，計(jì)算平均值，作為最終結(jié)果并記錄。

肝種植瘤最大徑在T1WI增強(qiáng)掃描圖像上進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)瘤灶均測(cè)量3次，取平均值并記錄。

5.病理形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化分析

所有實(shí)驗(yàn)兔完成第3次(即治療后第14天)DCE-MRI掃描后，通過(guò)空氣栓塞處死。取腫瘤組織及瘤周正常組織進(jìn)行蠟塊包埋、切片(切片層面與成像層面保持一致，均為矢狀位)，行HE染色及VEGF、CD34(MVD)免疫組化指標(biāo)檢查，選擇病灶最大層面進(jìn)行分析。

VEGF及CD34免疫組織參照weidner等[3]的判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤內(nèi)的孤立內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇被染成棕黃色的，并且與鄰近微血管或其他結(jié)締組織分開(kāi)的認(rèn)為是一個(gè)微血管。高倍鏡(×200)觀察，選擇5個(gè)染色明顯的視野，并記錄每個(gè)視野下微血管數(shù)目，計(jì)算其平均數(shù)，得到微血管密度(microvessel density，MVD)值。

VEGF染色結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞定義為胞漿內(nèi)含有棕黃色或棕褐色顆粒的腫瘤細(xì)胞。低倍鏡下(×100 )選擇棕褐色染色區(qū)域，高倍鏡下(×400 )選取4個(gè)染色明顯的視野，間質(zhì)染色不計(jì)入其內(nèi)，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目及占視野內(nèi)所有細(xì)胞數(shù)目的百分比，計(jì)算平均值并記錄。

病理切片HE染色及免疫組化的結(jié)果由病理科醫(yī)生在雙盲情況下按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察并記錄。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組治療前的基線數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間DCE-MRI參數(shù)Ktrans、Kep值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.882,P=0.001；F=5.031,P=0.049，圖1～4)，且Ktrans值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.062,P<0.01 ，圖5，表1)，Kep值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.181，P=0.836，表2 )。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Ve、Vp值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.327，P=0.272；F=0.236，P=0.638)，且Ve、Vp值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.088，P=0.916；F=0.127，P=0.881)。

表1 兩組肝種植瘤治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的Ktrans值測(cè)量結(jié)果

注：a不滿(mǎn)足協(xié)方差矩陣球?qū)ΨQ(chēng)條件，進(jìn)行H-F校正，校正系數(shù)為0.759；b實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間Ktrans值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；cKtrans值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)是不同的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組肝種植瘤治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的Kep值測(cè)量結(jié)果

注：a滿(mǎn)足協(xié)方差矩陣球?qū)ΨQ(chēng)條件；b實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間Kep值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；cKep值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)組治療7天后腫瘤直徑增大(0.23±0.06) cm，治療14天后腫瘤直徑增大(0.43±0.21) cm；對(duì)照組治療7天后腫瘤直徑增大(0.31±0.09) cm，治療14天后腫瘤直徑增大(1.48±0.56) cm。治療7天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療14天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

索拉非尼組的CD34染色結(jié)果顯示肝種植瘤內(nèi)散在的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色，主要位于腫瘤的邊緣(圖6、7)，免疫組化分析顯示兩組間MVD、VEGF差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示Ktrans與MVD、VEGF之間呈正相關(guān)(r值分別為0.792和0.651)。其他定量參數(shù)Kep、Ve、 Vp與MVD、VEGF均無(wú)顯著相關(guān)性(表3、4)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Ktrans偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區(qū)域)，Ktrans均值為(0.33±0.11)/min； b) 索拉非尼治療7天后，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)部分低血流灌注區(qū)(藍(lán)色區(qū)域)，Ktrans均值為(0.23±0.06)/min； c) 索拉非尼治療14d后，腫瘤稍增大，內(nèi)部呈低血流灌注(藍(lán)色區(qū)域)，Ktrans均值為(0.13±0.02)/min。 圖2 實(shí)驗(yàn)組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Kep偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區(qū)域)，Kep均值為(2.43±1.20)/min； b) 索拉非尼治療7天后，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)少量低血流灌注區(qū)(藍(lán)色區(qū)域)，Kep均值為(1.76±0.87)/min； c) 索拉非尼治療14d后，腫瘤稍增大，內(nèi)部有部分低血流灌注區(qū)(藍(lán)色區(qū)域)，Kep均值為(1.09±0.68)/min。

參數(shù)r值P值Ktrans0．7920．002Kep-0．160．96Ve0．0310．924Vp-0．0390．904

表4 DCE-MRI參數(shù)與VEGF之間的相關(guān)性

討 論

根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(如RECIST1.1標(biāo)準(zhǔn))及改良的mRECIST標(biāo)準(zhǔn)[4,5]，其評(píng)價(jià)結(jié)果可分為完全緩解、部分緩解、進(jìn)展及穩(wěn)定，但單純的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可能不能及時(shí)、準(zhǔn)確地反映腫瘤對(duì)藥物治療的敏感性，而血流量、轉(zhuǎn)移常數(shù)等功能學(xué)參數(shù)關(guān)注腫瘤內(nèi)部的血流灌注信息，在腫瘤大小改變之前即可出現(xiàn)變化。DCE-MRI從微血管水平對(duì)組織器官的微循環(huán)功能狀態(tài)進(jìn)行觀測(cè)、評(píng)價(jià)[6]，并且避免了CT灌注掃描過(guò)高的輻射劑量[7]，其應(yīng)用的數(shù)學(xué)模型更貼近真實(shí)的微環(huán)境，可提供更多的微循環(huán)信息，為腫瘤分子靶向治療療效評(píng)估提供了新的途徑。本研究將RECIST1.1標(biāo)準(zhǔn)作為評(píng)估靶向治療的標(biāo)準(zhǔn)，索拉非尼治療7天后，實(shí)驗(yàn)組腫瘤最大徑與對(duì)照組變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療14天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明了索拉非尼治療有效。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間Ktrans、Kep值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ktrans值在兩組間不同觀察時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)是不同的，在索拉非尼治療7天后，兩組間Ktrans值的差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DCE-MRI定量參數(shù)能評(píng)價(jià)分子靶向藥物抗血管生成治療的早期療效。

圖3 對(duì)照組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Krans偽彩圖。a) 治療前，腫瘤以高血流灌注為主(紅或黃色區(qū)域)，Ktrans均值為(0.35±0.09)/min； b) 安慰劑治療7天后，腫瘤增大，Ktrans均值為(0.37±0.06)/min; c) 安慰劑治療14d后，腫瘤明顯增大， Ktrans均值為(0.41±0.08)/min。 圖4 對(duì)照組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Kep偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區(qū)域)，Kep均值為(3.12±2.13)/min； b) 安慰劑治療7天后，腫瘤稍增大，Kep均值為(2.75±0.72)/min； c) 安慰劑治療14d后，腫瘤明顯增大，Kep均值為(1.47±0.69)/min。

龔?fù)萚8]學(xué)者應(yīng)用DCE-MRI評(píng)價(jià)恩度對(duì)兔VX2骨腫瘤抗血管生成的療效，14 d后治療組Ktrans值明顯下降， 且Ktrans值與VEGF表達(dá)、MVD值均呈正相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。楊蕊夢(mèng)等[9]應(yīng)用血管阻斷劑M410治療兔VX2種植性肝癌，治療后4 h行DCE-MRI檢查，治療組Ktrans值即開(kāi)始下降。丁爽等[10]使用安維汀治療結(jié)腸癌(裸鼠皮下移植瘤模型)，治療后24、48 h行DCE-MRI檢查，兩組間Kep值差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與免疫組織化學(xué)結(jié)果呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致。Wang等[11]研究認(rèn)為，Ktrans值主要由血流灌注和毛細(xì)血管通透性決定。肝種植瘤經(jīng)索拉非尼治療后，腫瘤MVD減低，血流量減少，同時(shí)毛細(xì)血管通透性下降，使兩組間Ktrans值的差別更明顯。Kep值不僅受血流灌注量、血管通透面積等因素的影響，血管外細(xì)胞外組織間隙內(nèi)流體靜水壓等其他因素的影響亦不能忽略，故兩組間Kep值的變化不如Ktrans值明顯。在本研究中，選用雙室Tofts血流動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行分析[12]，治療前后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組間Ve、Vp值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，筆者認(rèn)為Ve、Vp評(píng)價(jià)索拉非尼抑制兔VX2肝種植瘤模型的價(jià)值尚不能肯定，有待于進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們使用雙輸入雙室Tofts模型，以往的報(bào)道中，受限于當(dāng)時(shí)的分析軟件，常常只對(duì)肝動(dòng)脈進(jìn)行計(jì)算，忽視了門(mén)靜脈供血，本研究選擇兔肝動(dòng)脈及門(mén)靜脈作為輸入血管，進(jìn)行擬合計(jì)算，這更符合肝臟腫瘤雙重血供的特點(diǎn)，計(jì)算更加準(zhǔn)確。雙室模型分別指兔VX2肝種植瘤微血管及血管外細(xì)胞外間隙，該模型將釓離子對(duì)比劑在動(dòng)脈內(nèi)的分布差異考慮在內(nèi)，所獲得的定量參數(shù)不僅可以反映單室模型所關(guān)注的血流量，而且可反映對(duì)比劑從血管內(nèi)滲透到血管外細(xì)胞外間隙的相關(guān)指標(biāo)，如血管的通透性等。與正常兔肝組織相比，肝種植瘤的Ktrans、Kep值較高，這與腫瘤新生血管成熟度較差、局部血流速度更快、內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大、血管表面滲透性增高的病理基礎(chǔ)相匹配[13]。

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝種植瘤分別于治療前、治療后7天、治療后14天測(cè)量的Ktrans值變化趨勢(shì)圖。實(shí)驗(yàn)組Ktrans值持續(xù)下降；對(duì)照組Ktrans值治療后持續(xù)升高。兩組治療前后Ktrans值的變化趨勢(shì)不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 免疫組化MVD結(jié)果(×200)。a) 實(shí)驗(yàn)組微血管密度較低； b) 對(duì)照組微血管密度較高。 圖7 免疫組化VEGF結(jié)果(×400)。a) 實(shí)驗(yàn)組VEGF呈低表達(dá)； b) 對(duì)照組VEGF呈高表達(dá)。

鏡下觀察CD34和VEGF免疫組織化學(xué)染色多聚集在肝種植瘤及周邊，經(jīng)索拉非尼治療后，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織血管生成受到抑制，VEGF及MVD數(shù)量減少，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明索拉非尼可以有效抑制兔VX2肝癌新生血管的生成。Ktrans與MVD、VEGF值具有較好的相關(guān)性(r=0.792，r=0.651)。Wang等[14]對(duì)比了DCE-MRI參數(shù)與VEGF、MVD、P53蛋白等參數(shù)，證實(shí)DCE-MRI可以評(píng)估肝癌新生血管及其狀態(tài)。Wedam等[15]為了評(píng)估bevacizumab(VEGFR受體的單克隆抗體)治療乳腺浸潤(rùn)性癌的療效，行DCE-MRI檢查并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Ktrans、Kep值下降，并與VEGF受體表達(dá)呈正相關(guān)。

本研究存在以下局限性：①樣本量較小，可能導(dǎo)致部分研究結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②定量參數(shù)測(cè)量數(shù)據(jù)量大，測(cè)量繁瑣；③DCE-MRI掃描技術(shù)仍存在局限性，首先是掃描協(xié)議的不同，不同MRI掃描儀使用的掃描序列不同，會(huì)影響獲得的定量參數(shù)的準(zhǔn)確性；④不同實(shí)驗(yàn)選擇的血流動(dòng)力學(xué)模型也不相同，得到的結(jié)果可能存在差異。

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