便攜式葡萄糖傳感器即時(shí)檢測(cè)非葡萄糖目標(biāo)物的研究進(jìn)展

黃浩然 ， 竇文超 ， 趙廣英

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 浙江 杭州 310018)

電流型葡萄糖傳感器包含多個(gè)種類，目前應(yīng)用最多的是便攜式葡萄糖傳感器(personal glucose meter，PGM)，在快速、靈敏、準(zhǔn)確、便攜、經(jīng)濟(jì)和結(jié)果直觀可讀等方面具有突出優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來，PGM在檢測(cè)非葡萄糖目標(biāo)物方面引起國內(nèi)外動(dòng)物醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品安全和環(huán)境等多領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注且發(fā)展迅速，自Lu等(2011)[2]首報(bào)用PGM檢測(cè)非葡萄糖目標(biāo)物成功以來，各領(lǐng)域研究人員已解決了多種關(guān)鍵技術(shù)問題，成功研發(fā)了基于PGM的多類型檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)農(nóng)殘、獸殘、食品有害添加物、重金屬離子、致病微生物、病毒及真菌毒素的快速檢測(cè)。本文將從檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建、指示信號(hào)的產(chǎn)生、改善與放大和不同類型目標(biāo)物的檢測(cè)3方面進(jìn)行論述，以期推動(dòng)PGM在各檢測(cè)領(lǐng)域的快速發(fā)展。

1 不同類型檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建

基于PGM的非葡萄糖檢測(cè)體系有多種，如已見報(bào)道的DNA探針、免疫夾心法、核酸適配體技術(shù)、分子印跡技術(shù)等。

1.1 基于DNA探針的PGM即時(shí)檢測(cè) 用DNA探針以核酸互補(bǔ)配對(duì)方式檢測(cè)目標(biāo)物，具有非常高的特異性和靈敏度，適合用于核酸片段或小分子的檢測(cè)。Xu等(2015)[3]利用基于鏈置換反應(yīng)的DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)DNA，在聚合酶作用下，少量目標(biāo)DNA也可以使磁性納米粒子上的多條捕獲DNA與酶標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，起到放大信號(hào)的作用，提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)限為5.0×10-3pM。Luo等(2015)[4]利用DNA探針與多巴胺分子特異性結(jié)合后釋放部分DNA鏈的特性，構(gòu)建了一種基于PGM即時(shí)檢測(cè)多巴胺的方法。

1.2 基于夾心法的PGM即時(shí)檢測(cè) 夾心法檢測(cè)目標(biāo)物包括雙抗體夾心法和核酸適配體夾心法。Lu等(2012)[5]首次使用雙抗體夾心法檢測(cè)前列腺特異抗原。Sun等(2014)[6]用反膠束法將葡糖淀粉酶封裝在納米金團(tuán)簇內(nèi)，在96孔板表面和納米金團(tuán)簇表面分別修飾凝血酶適配體，從而與被測(cè)物形成夾心結(jié)構(gòu)。Wang等(2015)[7]用單克隆抗體捕獲，適配體標(biāo)記的方式檢測(cè)心臟生物標(biāo)志物肌紅蛋白，既提高了檢測(cè)的特異性，又提高了靈敏度，檢測(cè)限為50 pM。

2 指示信號(hào)的產(chǎn)生、改善與放大

改善和放大指示信號(hào)，能有效提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，是考量檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

2.1 分解基質(zhì)碳源產(chǎn)生葡萄糖 利用活細(xì)菌生長繁殖過程中分解基質(zhì)中特定碳源產(chǎn)生的葡萄糖，在一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)培養(yǎng)體系中葡萄糖含量并計(jì)算濃度差值△C，依據(jù)預(yù)先做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中的菌含量[8]。該方法中，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性、對(duì)于致病菌定性定量檢測(cè)的特異性等，通常取決于配套研制的具有嚴(yán)格選擇性的培養(yǎng)基，只有特定菌種才能實(shí)現(xiàn)。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，非常有實(shí)用價(jià)值，其不足在于研制成具有嚴(yán)格選擇性的適用培養(yǎng)基較難。

2.2 酶促水解產(chǎn)生葡萄糖或包埋后釋放葡萄糖 現(xiàn)有報(bào)道中多用酶促水解產(chǎn)生葡萄糖，用PGM檢測(cè)其量的變化。常用的酶包括蔗糖酶、葡萄糖淀粉酶以及淀粉葡萄糖苷酶等，其中蔗糖酶最為常用，Gao等(2016)[9]設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，在磁性納米粒子表面修飾多條雙鏈DNA，并通過親和素-生物素特異性結(jié)合蔗糖酶，由于未甲基化的雙鏈DNA會(huì)被限制性內(nèi)切酶HpaⅡ切斷并釋放蔗糖酶，因此葡萄糖信號(hào)較低則說明樣品中存在甲基轉(zhuǎn)移酶。近年來有研究者引入脂質(zhì)體作為媒介，如利用脂質(zhì)體包埋葡萄糖分子，用以檢測(cè)黃曲霉毒素[10]。Xue等(2017)[11]包被葡萄糖淀粉酶，再在脂質(zhì)體表面修飾DNA探針，當(dāng)甲基轉(zhuǎn)移酶存在時(shí)，限制性內(nèi)切酶DpnⅠ會(huì)特異性地切斷甲基化DNA鏈，釋放脂質(zhì)體囊泡，最后使囊泡破裂水解淀粉，檢測(cè)限可以達(dá)到0.002 U/L。利用脂質(zhì)體作為媒介可以放大信號(hào)、降低檢測(cè)限，但是由于其制作成本較高、難度較大，欲作為一種通用方法得到普及較難。

3 對(duì)不同類型目標(biāo)物的檢測(cè)

3.1 對(duì)獸藥殘留的檢測(cè) 濫用獸藥導(dǎo)致的有害物質(zhì)殘留對(duì)人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展都有很大危害，即時(shí)檢測(cè)氯霉素、萊克多巴胺等獸藥殘留有助于進(jìn)一步降低動(dòng)物源性食品的安全風(fēng)險(xiǎn)。

Chen等(2015)[12]以磁性納米粒子為載體，用分子印跡技術(shù)在納米粒子表面留下空隙，實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)氯霉素分子。Gan等(2014)[13]在磁性納米粒子表面修飾β-環(huán)狀糊精(簡稱β-CD)，β-CD可與萊克多巴胺上的苯環(huán)形成包結(jié)復(fù)合物，再在Envision試劑的聚糊精胺骨架表面修飾大量蔗糖酶用于信號(hào)放大，使最低檢測(cè)限達(dá)到0.34 ng/mL，且檢測(cè)時(shí)間遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的色譜法和ELISA法。

3.2 飼料中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè) 飼料作為影響動(dòng)物源性食品安全的源頭物質(zhì)，加強(qiáng)監(jiān)管、完善即時(shí)檢測(cè)方法具有重要意義。基于PGM檢測(cè)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料中有毒有害污染物包括重金屬離子、黃曲霉毒素和三聚氰胺等的即時(shí)檢測(cè)。Lu等(2013)[14]利用鉛離子會(huì)使特定DNA鏈斷裂的特性，設(shè)計(jì)以磁性納米粒子為載體的檢測(cè)方法，對(duì)鉛離子檢測(cè)限為75 nM。Zhang等(2015)[15]設(shè)計(jì)在96孔板表面修飾鏈霉親和素，再連接基板鏈和催化鏈，當(dāng)鉛離子存在時(shí)，基板鏈斷裂并連接互補(bǔ)DNA鏈，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的檢測(cè)，該方法檢測(cè)限可低至1 pM。

汞也是飼料的主要污染因素之一，在人體內(nèi)富集會(huì)造成不可逆的DNA損傷和中樞神經(jīng)損傷。有研究表明，汞離子可通過N-Hg鍵形成胸腺嘧啶-汞-胸腺嘧啶錯(cuò)配的特殊結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度高于氫鍵。唐點(diǎn)平課題組利用這一特殊結(jié)構(gòu)，分別以96孔板和金電極為載體發(fā)表了兩篇PGM即時(shí)檢測(cè)汞離子的文章。一是在DNA鏈的一端連接納米金包被的蔗糖酶，用于信號(hào)輸出，對(duì)汞的檢測(cè)限為10 pM[16]。二是用同樣的方法捕獲汞離子，但將載體換成了金電極，用于信號(hào)輸出的物質(zhì)改為納米金修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，增大了比表面積，因此能修飾更多蔗糖酶，使輸出信號(hào)更強(qiáng)，檢測(cè)限進(jìn)一步降低到了4.2 pM[17]。Fang等(2016)[18]利用重金屬離子對(duì)微生物葡萄糖消耗的抑制作用，設(shè)計(jì)了一套檢測(cè)多種重金屬的方法，更加經(jīng)濟(jì)、簡便。

Tang等(2016)[10]報(bào)以96孔板為載體，以免疫夾心法檢測(cè)黃曲霉毒素，在標(biāo)記抗體一端連接封裝有葡萄糖分子的脂質(zhì)體，最后用表面活性劑釋放葡萄糖產(chǎn)生信號(hào)。另外，清華大學(xué)與美國伊利諾伊大學(xué)合作開發(fā)了一種PGM即時(shí)檢測(cè)三聚氰胺的方法[19]。研究人員將BDNA與酶標(biāo)DNA一起與三聚氰胺適配體互補(bǔ)結(jié)合，并巧妙地利用了三聚氰胺與其適配體結(jié)合時(shí)的特性，即在三聚氰胺存在時(shí)，適配體會(huì)折疊成特殊的形狀，從而釋放出酶標(biāo)DNA。該方法在緩沖液中的檢測(cè)限為41.1 μg/mL，在牛奶樣品中為67.5 μg/mL，均接近美國標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 對(duì)病原微生物的檢測(cè) 病原微生物檢測(cè)在醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要的研究價(jià)值，完善病原微生物即時(shí)檢測(cè)方法有助于提高治療效率、減少經(jīng)濟(jì)損失。Joo等(2013)[20]利用雙抗體夾心法結(jié)合PGM，在標(biāo)記抗體一端修飾蔗糖酶，用以檢測(cè)沙門菌，相較于傳統(tǒng)的ELISA法，靈敏性和準(zhǔn)確度都有所提升，檢測(cè)限為10 CFU/mL。Ren等(2015)[21]通過靜電吸附作用，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的方法。即在磁性納米粒子表面包硅，處理后得到一種可以靠靜電吸附酶和微生物的納米粒子，因大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，納米粒子會(huì)緊緊吸附在菌體表面，從而釋放原本吸附的葡萄糖淀粉酶，再通過酶促反應(yīng)釋放信號(hào)。本研究室自2013年開始進(jìn)行PGM即時(shí)檢測(cè)病原微生物研究至今，完成了多項(xiàng)檢測(cè)研究[8,22]。解決了多個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸埃希菌計(jì)數(shù)、菌落總數(shù)測(cè)定、嗜熱脂肪芽孢桿菌定性和定量檢測(cè)，弧菌屬細(xì)菌和克洛諾阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)等，在致病微生物檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3.4 對(duì)病毒的檢測(cè) 血糖儀用于病毒的即時(shí)檢測(cè)也有報(bào)道，Lu等(2012)[23]利用核酸的特異性雜交，將捕獲探針修飾在磁性納米粒子上，與酶標(biāo)探針一同形成乙肝核酸的互補(bǔ)鏈，同時(shí)，改變片段上的一個(gè)堿基，設(shè)計(jì)多個(gè)錯(cuò)配的核酸片段以驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果顯示，該方法較好地實(shí)現(xiàn)了在生物樣品中對(duì)乙肝核酸序列的選擇性檢測(cè)，檢測(cè)限為40 pM。Wang(2014)[24]等結(jié)合微流控芯片，利用其高通量、多通道的特性，設(shè)計(jì)檢測(cè)3種乙肝病毒核酸，通過親合素-生物素在通道表面修飾大量捕獲DNA，提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)限低至10 pM，且可多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。

4 展望

目前，PGM即時(shí)檢測(cè)的拓展研究展現(xiàn)出了令人欣喜的成果，并顯示出了很大的應(yīng)用潛力。用該方法結(jié)合其他新技術(shù)和新材料可進(jìn)一步提高靈敏度和準(zhǔn)確性。從已有的研究成果來看，該方法在動(dòng)物源性食品安全、飼料安全檢測(cè)等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。更重要的是，該法所需時(shí)間短，檢測(cè)價(jià)格低廉，靈敏度高，且對(duì)設(shè)備和人員要求低，適于制成試劑盒供養(yǎng)殖戶和商家使用，同時(shí)也為欠發(fā)達(dá)地區(qū)的動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測(cè)提供了新的方法。但其也存在不足之處，如市售血糖儀種類繁多，不同品牌的血糖儀對(duì)同一樣品的定量檢測(cè)結(jié)果有時(shí)會(huì)有較大差異，因此使用不同品牌儀器的實(shí)驗(yàn)室需各自預(yù)先建立自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傊?，基于PGM的即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)非葡萄糖目標(biāo)物時(shí)具有廣闊的應(yīng)用前景，相信在不久的將來，該方法能在動(dòng)物醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域取得長足進(jìn)展。

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